劉 洋,陳永娟,王曉燕,3*,許康利,楊志偉

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水庫與河流沉積物中好氧甲烷氧化菌群落差異性研究

劉 洋1,2,陳永娟1,王曉燕1,3*,許康利1,楊志偉4

(1.首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院,北京 100048；2.中國水利水電科學(xué)研究院,北京 100038；3.首都師范大學(xué)首都圈水環(huán)境研究中心,北京 100048；4.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100048)

甲烷在自然生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過程中起著重要作用,氮素形態(tài)的差異影響了甲烷氧化菌的氧化作用. 選取北京市密云水庫和北運(yùn)河兩類不同污染類型的水體作為研究區(qū)域,采用克隆文庫分子生物學(xué)的方法,探究氮素形態(tài)及其來源的差異對MOB細(xì)菌群落特征的影響. 結(jié)果表明:密云水庫與北運(yùn)河沉積物中氮素形態(tài)有顯著差異,水庫中氮素以NO3--N為主,河流中氮素以NH4+-N為主;氮素形態(tài)的差異影響了MOB細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育,密云水庫沉積物中MOB細(xì)菌的高同源性菌群主要來自湖泊生態(tài)系統(tǒng),與NO3--N有較強(qiáng)的響應(yīng)關(guān)系,北運(yùn)河沉積物中MOB細(xì)菌高同源性菌群主要來自污水處理廠廢水和活性淤泥,與NH4+-N有較強(qiáng)的響應(yīng)關(guān)系,不同環(huán)境中氮素對MOB細(xì)菌的影響主要依賴于氮素的主要存在形態(tài)及其主要來源. 北運(yùn)河等重污染河流中MOB細(xì)菌群落的聯(lián)系更緊密更趨于模塊化,對環(huán)境變化的敏感程度更高,微生物更脆弱,更容易受到水質(zhì)變化以及人類活動的干擾. 北運(yùn)河沉積物中NH4+-N對MOB細(xì)菌氧化速率的抑制性強(qiáng)于密云水庫沉積物中NO3--N對甲烷氧化的抑制作用. 重污染的城市河流中高濃度的NH4+-N通過抑制甲烷氧化速率和促進(jìn)產(chǎn)甲烷產(chǎn)生速率的雙重作用影響了河流沉積物中甲烷的產(chǎn)生.

沉積物；好氧甲烷氧化菌；氮素形態(tài)；群落結(jié)構(gòu)；系統(tǒng)發(fā)育；環(huán)境因子；共存關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

甲烷(CH4)的排放是自然生態(tài)系統(tǒng)中不可忽視的問題,其單位分子的增溫潛力是CO2的25倍,平均存留時(shí)間為CO2的4倍,在自然生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過程中起著重要作用[1-5].甲烷氧化菌是甲烷重要的生物匯,能消耗轉(zhuǎn)化生態(tài)系統(tǒng)中約76%~90%的甲烷,對保持大氣甲烷濃度的平衡具有重要的意義[1-5].好氧甲烷氧化菌(MOB)在自然環(huán)境中分布廣泛,能以甲烷作為碳源和能源,將90%由產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生的甲烷氧化[7].影響甲烷氧化菌的化學(xué)因素主要有氧氣/水分狀況/重金屬以及含氮化合物等[8],有研究表明外源氮肥對MOB細(xì)菌的影響較復(fù)雜,不同的環(huán)境中氮素含量的差異能影響MOB細(xì)菌的氧化作用[9].

全球CH4排放量約500~600Tg/a,其中濕地是最大的排放源,占總排放量的23%,中國有水庫約80000個(gè),河流1500多條,其中水庫流域面積超過1000km2,成為CH4排放的熱點(diǎn)區(qū)域[10-11].密云水庫是北京市重要的引用水源地,為保證水質(zhì)安全,水庫水體保持在中營養(yǎng)的狀態(tài),流域內(nèi)甲烷的釋放量每年呈現(xiàn)增加的趨勢[12].水庫中氮磷的污染仍不容忽視,其主要受到流域沿岸的農(nóng)業(yè)面源污染的影響[13].汛期降水徑流攜帶的污染物影響水質(zhì)狀況,氮素存在狀態(tài)以NO3-為主.北運(yùn)河是北京市主要的排污泄洪河道,主要流經(jīng)北京市人類活動最頻繁的北部和東部地區(qū),受人類活動影響變化劇烈[14].作為北京市主要的排污河道,大量未經(jīng)處理的工農(nóng)業(yè)廢水、城市生活污水和污水處理廠的退水排入河道,導(dǎo)致水體氨氮含量嚴(yán)重超標(biāo)[15-17].北運(yùn)河河道水流緩慢導(dǎo)致沉積物大量淤積,而污染物質(zhì)的沉降/吸附使得沉積物成為內(nèi)源污染源[18].密云水庫和北運(yùn)河從污染類型,污染物質(zhì)來源以及氮素的主要污染類型均存在差異性.

目前氮素形態(tài)對MOB細(xì)菌群落特征影響的研究主要集中在不同施肥土壤氮素形態(tài)對MOB細(xì)菌群落特征的影響[19-20]及在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬氮素的不同形態(tài)及不同的添加濃度對MOB細(xì)菌群落特征及甲烷氧化速率的影響[20-21].淡水生態(tài)系統(tǒng)中外源氮素對MOB細(xì)菌的影響主要借鑒農(nóng)田土壤中氮素影響MOB細(xì)菌群落特征的相關(guān)研究.人類活動干擾程度/污染程度以及氮素形態(tài)差異較大的淡水生態(tài)系統(tǒng)中MOB細(xì)菌群落特征的差異性研究還存在明顯不足.密云水庫為北京市飲用水源地,人類活動干擾程度小,污染程度弱,營養(yǎng)物主要為NO3-;北運(yùn)河為北京市城市河流,人類活動干擾程度強(qiáng),水體污染嚴(yán)重,NH4+-N污染嚴(yán)重.本文選擇密云水庫和北運(yùn)河兩類污染程度及主要氮素形態(tài)截然不同的自然水體作為研究區(qū)域,通過對比沉積物中氮素形態(tài)的差異,分析氮素污染類型及氮素來源的差異對MOB細(xì)菌的群落多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的影響,探究不同氮素污染類型水體對MOB細(xì)菌與環(huán)境因子相應(yīng)關(guān)系的差異,進(jìn)一步解釋污染程度的差異對淡水生態(tài)系統(tǒng)中甲烷氣體產(chǎn)生和消耗的影響,為不同污染類型水體MOB細(xì)菌的氧化過程的調(diào)控作用提供理論基礎(chǔ),也為控制重污染河流中甲烷等溫室氣體的排放提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別于2015年7月和2016年7月于密云水庫和北運(yùn)河采集樣品,使用抓泥斗采集底泥樣品(0~5cm)約1kg.依據(jù)研究區(qū)域樣點(diǎn)均勻分布的原則,如圖1所示,密云水庫內(nèi)布設(shè)8個(gè)采樣點(diǎn),北運(yùn)河內(nèi)共設(shè)置7個(gè)采樣點(diǎn)(樣點(diǎn)主要集中在人類活動干擾強(qiáng)度大的中下游).

采集到的樣品在聚氯乙烯塑料瓶-4℃儲存,24h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室.所有樣品分為兩部分:一部分用冷凍干燥機(jī)(Alpha 1-2LD plus; Martin Christ, Germany)烘干,研磨過200目篩后用于理化分析;另一部分樣品放入-80℃超低溫冰箱保存,用于后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn).

圖1 密云水庫和北運(yùn)河采樣點(diǎn)分布

1.2 樣品理化分析

水質(zhì)指標(biāo)使用多參數(shù)水質(zhì)儀(HYDROLABMS5) (HACH,美國)現(xiàn)場測定,包括溫度(T)、pH值、溶解氧(DO)、鹽度(Salinity)等.其他理化指標(biāo)依照《土壤農(nóng)化分析(第5版)》的方法[22]進(jìn)行測定.沉積物中氨氮(NH4+-N),硝態(tài)氮(NO3--N),亞硝態(tài)氮(NO2--N)和總磷(TP),用2mol/L KCl溶液浸提,浸提懸浮液離心過濾,使用FIASTAR 5000連續(xù)流動進(jìn)樣分析儀(FOSS,丹麥)進(jìn)行測定;TOC使用總有機(jī)碳分析儀進(jìn)行測定(Liqui TOCⅡ,德國);TN按照凱式定氮法使用凱氏定氮儀(KDY-9830)進(jìn)行測定.

1.3 DNA提取和amoA基因PCR擴(kuò)增

表1 N-DAMO和MOB細(xì)菌所需引物和溫度程序

沉積物中的DNA使用Power Soil DNA kit(Mo Bio Laboratories,Carlsbad, California, USA)試劑盒,依據(jù)說明說提取.MOB細(xì)菌的基因擴(kuò)增引物為A189F和Mb661R,PCR擴(kuò)增的主要溫度程序見表1.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用MOTHUR軟件以5%的差異度劃分獨(dú)立操作單元(operational taxonomic unit, OUT),計(jì)算香農(nóng)多樣性指數(shù)/辛普森指數(shù)和Chao1指數(shù)[23].使用MEGA 4軟件[25]以鄰位相連法(Neighbor- Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.使用STAMP軟件[26]基于T-TEST方法計(jì)算兩樣本之間的差異.使用R 3.3.2的psych package 1.7.5[27]計(jì)算樣本間微生物之間的共生關(guān)系,并進(jìn)一步使用Cytoscape 3.5.1[28]軟件構(gòu)建微生物的共生網(wǎng)絡(luò)關(guān)系.使用R 3.3.2軟件的Vegan package 2.4[29]冗余分析(RDA)計(jì)算生物群落分布與環(huán)境因子的相關(guān)性,通過mantel及partial mantel檢驗(yàn)方法識別各環(huán)境因子的影響及貢獻(xiàn).采用SPSS(PASW statistics 18.0)軟件對理化數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果和討論

2.1 底泥氮素形態(tài)差異

對比分析密云水庫和北運(yùn)河沉積物的理化參數(shù)(基于T-test方法)(圖2).密云水庫沉積物中氨氮(NH4+-N)和總磷(TP)均顯著低于北運(yùn)河沉積物中的相關(guān)指標(biāo)(<0.05),密云水庫沉積物中硝態(tài)氮(NO3--N)/亞硝態(tài)氮(NO2--N)和C/N均顯著高于北運(yùn)河沉積物中的相關(guān)指標(biāo)(<0.05).北運(yùn)河底泥中NH4+-N占總氮的78.70%,為氮素的主要形態(tài),密云水庫底泥中NO3--N占總氮的42.97%.

密云水庫為北京市的引用水源地,人類活動干擾小,水庫處于中營養(yǎng)狀態(tài)并有向富營養(yǎng)發(fā)展的趨勢[30].李冬青等[31]和秦麗歡等[32]分別對密云水庫水質(zhì)及營養(yǎng)鹽變化進(jìn)行了研究,均發(fā)現(xiàn)密云水庫水體氮素以NO3--N為主.北運(yùn)河作為北京市的泄洪排污河道,人類活動干擾大,氨氮污染嚴(yán)重[15,18].北運(yùn)河水體中高濃度的氨氮一方面來源于未經(jīng)處理的工農(nóng)業(yè)廢水/城市生活污水及污水處理廠退水的匯入,另一方面來自農(nóng)業(yè)灌溉的輸出[33].陳永娟等[34]對北運(yùn)河污染物通量的研究證實(shí)了水體中高濃度的NH4+-N主要來自污水處理廠出水及農(nóng)業(yè)灌溉的輸入.本文沉積物理化指標(biāo)結(jié)果表明,NH4+-N為北運(yùn)河沉積物中氮素的主要存在形態(tài).于洋等[35]和鮑林林等[18]對北運(yùn)河的相關(guān)研究均表明NH4+-N是北運(yùn)河沉積物中氮污染的主要形態(tài).密云水庫沉積物和北運(yùn)河沉積物中氮素的主要形態(tài)存在顯著差異,前者以NO3--N為主,后者以NH4+-N為主,兩個(gè)研究區(qū)域沉積物中氮素的主要形態(tài)均與水體中氮素的主要形態(tài)一致.

圖2 密云水庫沉積物和北運(yùn)河沉積物理化指標(biāo)差異(MY:密云水庫;BY:北運(yùn)河)

2.2 MOB細(xì)菌多樣性指標(biāo)差異

密云水庫沉積物中MOB細(xì)菌共擴(kuò)增出222條基因序列,覆蓋范圍均為0.66~0.96;北運(yùn)河沉積物中MOB細(xì)菌共擴(kuò)增出基因序列166條,覆蓋范圍均為0.58~0.83,密云水庫和北運(yùn)河沉積物中MOB細(xì)菌序列均具有代表性(表2).基于5%的基因差異,密云水庫沉積物中MOB細(xì)菌劃分出2~23個(gè)OTUs(平均值=7.75),香農(nóng)指數(shù)(Shannon)指數(shù)范圍為0.15~3.04,Simpson指數(shù)范圍為0.02~0.93;北運(yùn)河劃分出5~19個(gè)OTUs(平均值=6.86),Shannon指數(shù)范圍為1.36~2.78,Simpson指數(shù)范圍為0.01~0.26.基于T-test方法,對比分析密云水庫中MOB細(xì)菌的多樣性指標(biāo)和北運(yùn)河中MOB細(xì)菌的多樣性指標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有顯著性差異(>0.05).云南不同土地利用類型的淡水湖泊沉積物中MOB細(xì)菌劃分OTUs的范圍為16~23,Shannon指數(shù)范圍為2.53~2.79[36].中國云南高原13個(gè)富營養(yǎng)淡水湖泊底泥中MOB細(xì)菌劃分出11~30個(gè)OTUs,Shannon指數(shù)范圍為2.24~3.12[36].密云水庫中MOB細(xì)菌和北運(yùn)河中MOB細(xì)菌的OTUs個(gè)數(shù)和Shannon指數(shù)均與淡水生態(tài)系統(tǒng)中MOB細(xì)菌相關(guān)指標(biāo)一致.

表2 密云水庫和北運(yùn)河底泥中MOB細(xì)菌多樣性指標(biāo)

注: M:密云水庫;B:北運(yùn)河.

2.3 MOB細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹差異

選取MOB細(xì)菌具有代表性的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析.密云水庫中MOB細(xì)菌共分為4個(gè)分支[圖3(a)].ClustersⅠ(42.34%)和ClustersⅢ(13.06%)分別為第一大和第三大分支,兩者均與淡水湖泊[36]中的MOB細(xì)菌有較高的同源性,ClustersⅢ分支中MOB細(xì)菌與純培養(yǎng)sp(Ⅰ型MOB)的同源性較高. ClustersⅡ和ClustersⅣ分別為第二大和最小的分支,前者與土壤純培養(yǎng)的(Ⅰ型MOB)和(Ⅰ型MOB)同源性高,后者與純培養(yǎng)的(Ⅰ型MOB)同源性高.

北運(yùn)河中MOB細(xì)菌共分為3個(gè)分支[圖3(b)].ClustersⅠ為最大的分支(42.17%),高同源性菌群主要來自廢水淤泥[38]和活性淤泥[39]. ClustersⅡ(39.76%)和ClustersⅢ (13.06%)分別為第二大和第三大分支,前者與湖泊[40]中MOB細(xì)菌的同源性高,后者主要與稻田土壤[41]和純培養(yǎng)、和(Ⅱ型MOB)的同源性高.基于Bray-Curtis距離算法對細(xì)菌群落進(jìn)行Heatmap分析(圖4),MOB細(xì)菌共聚為3類,第一聚類以密云水庫為主(M5、M3、M4、M8、M7、B9和B7),第二聚類以北運(yùn)河為主(B5、B8、B3、M1和B2).

系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示,TypeⅠ型的MOB細(xì)菌在密云水庫和北運(yùn)河中占主導(dǎo),前者高同源性菌群主要來自湖泊生態(tài)系統(tǒng),后者主要來自活性淤泥和廢水淤泥.云南13個(gè)淡水湖泊[23]和美國阿拉斯加北部的Qalluuraq湖泊[42]中均發(fā)現(xiàn)TypeⅠ型MOB細(xì)菌占主導(dǎo)地位.華盛頓湖[43]、康士坦茨湖[44]、Stechlin湖[45]及我國淡水沼澤濕地[23]的相關(guān)研究均證明了TypeⅠ型MOB細(xì)菌是我國淡水湖泊沉積物中的優(yōu)勢菌種.人類活動的干擾導(dǎo)致北運(yùn)河岸邊水土流失嚴(yán)重,大量的農(nóng)田土壤隨雨水匯入河中[33].由于缺乏自然徑流,北運(yùn)河依靠污水處理廠的再生水補(bǔ)給,處理廠的再生水?dāng)y帶設(shè)施中的微生物一同匯入北運(yùn)河[15].北運(yùn)河系統(tǒng)發(fā)育樹ClustersⅢ與農(nóng)田土壤中細(xì)菌的同源性高.有研究表明TypeⅠ型和TypeⅡ型的MOB細(xì)菌均可在農(nóng)田土壤中被檢測,其中TypeⅡ型的MOB細(xì)菌占主導(dǎo)地位[36].北運(yùn)河系統(tǒng)發(fā)育樹ClustersⅠ中細(xì)菌與活性淤泥及廢污水中MOB細(xì)菌有較高的同源性.鮑林林等[17-18]對北運(yùn)河沉積物中的脫氮功能微生物及氨氧化微生物群落特征的研究發(fā)現(xiàn),兩種細(xì)菌均與廢水和活性污泥中的類群同源性高[17-18].不同功能細(xì)菌的研究均證實(shí)了北運(yùn)河沉積物中微生物群落受到了周邊污水處理設(shè)施及未經(jīng)處理的生活污水的影響,北運(yùn)河水體環(huán)境的改變會對MOB細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及細(xì)菌的來源產(chǎn)生影響.

圖3 密云水庫(a)和北運(yùn)河(b)pmoA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 MOB細(xì)菌Heatmap分析(基于Bray-Curtis距離)

2.4 共存關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Co-occurrence Network差異性

MOB細(xì)菌的共存關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(co-occurrence network)可以用來評估復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)中微生物之間以及微生物與環(huán)境因子之間的相互關(guān)系,能表征棲息地環(huán)境特征與微生物群落之間的聚集關(guān)系[46-48].通過MOB細(xì)菌的Network分析,北運(yùn)河中MOB細(xì)菌的共生關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中共有25個(gè)點(diǎn),52條相關(guān)線[圖5(b)],密云水庫中MOB細(xì)菌的共生關(guān)系較復(fù)雜,共15個(gè)點(diǎn),71條相關(guān)線[圖5 (a)].MOB的OTUS與環(huán)境因子的相關(guān)性來看,北運(yùn)河中的相關(guān)性更強(qiáng).環(huán)境的異質(zhì)性及理化特征的復(fù)雜程度來看,北運(yùn)河環(huán)境的異質(zhì)性更高、理化特征的復(fù)雜性更強(qiáng).

圖5 密云水庫(a)和北運(yùn)河(b) MOB細(xì)菌Network分析

圓點(diǎn)代表MOB細(xì)菌的OTUs,線段代表相關(guān)性,只有<0.05的相關(guān)關(guān)系在圖中顯示

表3 密云水庫和北運(yùn)共存關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)

對比分析密云水庫和北運(yùn)河拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)參數(shù)(表3),北運(yùn)河的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)范圍更大、結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性更強(qiáng)及特征路徑更長.密云水庫MOB細(xì)菌和北運(yùn)河MOB細(xì)菌的中心化程度、集聚系數(shù)均較高.網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)拓?fù)鋱D中點(diǎn)的分布和以及點(diǎn)與點(diǎn)之間的相互關(guān)系能影響系統(tǒng)的穩(wěn)定性[49-50].模塊化程度(Modularity) >0.4表明網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D已經(jīng)形成模塊化[51],用于表征微生物群落生態(tài)位的分化程度,模塊化程度越高微生物生長的生態(tài)位分化程度越高.模塊化程度可以表征微生物各個(gè)模塊群落之間的聯(lián)系緊密程度,模塊化程度越高表征微生物群落模塊內(nèi)物種之間的聯(lián)系越緊密,微生物群落越脆弱,受到環(huán)境變化的干擾程度越高[48,52].就模塊化程度而言,重污染的北運(yùn)河沉積物中MOB細(xì)菌的OTUS之間的模塊化程度更高,細(xì)菌更脆弱,微生物對環(huán)境改變的敏感性更強(qiáng),MOB細(xì)菌受到人類活動干擾的程度更高.

2.5 相關(guān)環(huán)境因子差異性

依據(jù)Pearson相關(guān)性分析(表4),密云水庫MOB細(xì)菌和北運(yùn)MOB細(xì)菌的多樣性指標(biāo)均與三態(tài)氮(NH4+-N、NO3--N、NO2--N)、TN和TOC有顯著的相關(guān)關(guān)系(<0.05).密云水庫系統(tǒng)發(fā)育樹的ClustersⅠ和ClustersⅢ分支的MOB細(xì)菌均與NO3--N有顯著相關(guān)關(guān)系.北運(yùn)河系統(tǒng)發(fā)育樹ClustersⅠ分支的MOB細(xì)菌與NH4+-N有顯著相關(guān)關(guān)系.結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹的分析,北運(yùn)河沉積物中高同源性的MOB細(xì)菌主要來自廢水淤泥,高濃度的氨氮也主要來自未經(jīng)處理的廢污水及污水處理廠排水的匯入,北運(yùn)河中高濃度的污染物(NH4+-N)是MOB細(xì)菌的主要環(huán)境因子,污染物的來源進(jìn)一步影響了細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育和群落結(jié)構(gòu).

依據(jù)CCA分析,軸1和軸2的解釋變量分別為33.86%和21.86%,前兩個(gè)排序軸的總解釋變量為55.72% (圖6).依據(jù)Monte Carlo檢驗(yàn), NO3--N (0.94)與RDA1的相關(guān)性強(qiáng),NH4+-N (-0.87)、NO2--N (-0.79)和C/N (-0.81)與RDA2的相關(guān)性強(qiáng).北運(yùn)河樣點(diǎn)主要分布在RDA2軸,與NH4+-N有強(qiáng)響應(yīng)關(guān)系,而密云水庫樣點(diǎn)分布沒有規(guī)律性.依據(jù)Mantel檢驗(yàn),分析各個(gè)環(huán)境因子對微生物群落分布的影響,N和NH4+-N使用Mantel Partial檢驗(yàn)(TN和NH4+-N有較強(qiáng)相關(guān)性)(表5).NH4+-N對北運(yùn)河沉積物中MOB細(xì)菌群落分布有顯著影響(<0.05),而NO3--N和NO2--N對密云水庫沉積物中MOB細(xì)菌的影響顯著(< 0.05).Mantel檢驗(yàn)的結(jié)果證明,環(huán)境中氮素的主要存在形態(tài)對MOB細(xì)菌群落分布的影響顯著.

外源氮素通過刺激或抑制甲烷氧化菌的活性影響甲烷的氧化過程[53].一般而言,NH4+-N的輸入會抑制甲烷的氧化,因?yàn)镹H4+與CH4有相似的分子結(jié)構(gòu),NH4+通過與CH4競爭甲烷氧化酶系統(tǒng)相同的位點(diǎn),減少甲烷氧化酶的有效性途徑來抑制甲烷氧化菌的氧化作用[54].本研究中,北運(yùn)河沉積物中NH4+-N對MOB細(xì)菌多樣指標(biāo)及群落分布均有顯著影響.有研究表明,不同的氨氮濃度會對MOB細(xì)菌產(chǎn)生不同的抑制作用,低濃度的NH4+-N對氧化作用起到20%的抑制作用,隨著NH4+-N濃度的增加,NH4+-N對微生物氧化速率的抑制作用增強(qiáng)[55-56].齊潤杰等[56]通過向土壤中添加不同濃度的NH4+-N探究NH4+-N濃度的不同對甲烷氧化速率的影響,發(fā)現(xiàn)CH4氧化速率隨NH4+-N濃度的增加而下降,NH4+-N對CH4氧化的抑制率與其濃度呈極顯著正相關(guān).北運(yùn)河沉積物中高濃度NH4+-N抑制了MOB細(xì)菌的氧化速率,由于北運(yùn)河中NH4+-N濃度顯著高于密云水庫中NH4+-N濃度,NH4+-N對北運(yùn)河甲烷氧化的抑制率顯著高于密云水庫中NH4+-N對甲烷氧化的抑制率.NH4+-N除對甲烷氧化作用有抑制性之外,還會顯著促進(jìn)CH4的產(chǎn)生,土壤中NH4Cl的輸入使甲烷的產(chǎn)生率提高了136.7%[21].高濃度的NH4+-N通過抑制甲烷的氧化速率和促進(jìn)甲烷的產(chǎn)生速率的雙重作用影響了甲烷的產(chǎn)生.因此,氨氮污染嚴(yán)重河流中甲烷氣體釋放是值得關(guān)注的問題.

表4 MOB細(xì)菌多樣性指標(biāo)與環(huán)境因子Pearson相關(guān)性

注:*表示在0.05 水平上顯著相關(guān). **表示在0.01水平上顯著相關(guān);其他無顯著相關(guān).

除NH4+-N對甲烷氧化作用有抑制性外,NO3--N對甲烷的氧化也有直接的抑制作用[53,57]氮的不同存在形態(tài)對甲烷氧化產(chǎn)生不同的影響,且NH4+-N對甲烷氧化的抑制作用顯著強(qiáng)于NO3--N的抑制性作用[58].齊潤杰等[19]通過探究外源氮對5種不同類型的土壤甲烷氧化能力的影響,發(fā)現(xiàn)100(mg/kg)N添加的NO3--N僅對一種土壤有顯著的抑制效果,而相同濃度添加的NH4+能顯著降低5中土壤的氧化速率,抑制率為17.64~35.86%.本研究中,NO3--N是密云水庫沉積物中氮素的主要形態(tài),Pearson相關(guān)性、RDA分析及Mantel檢驗(yàn)均顯示NO3--N與水庫沉積物中MOB細(xì)菌有顯著相關(guān)關(guān)系.由于NO3--N對MOB細(xì)菌的抑制作用顯著低于NH4+-N[59],密云水庫中NO3--N對甲烷氧化速率的抑制作用低于北運(yùn)河中NH4+-N對甲烷氧化的抑制作用.有研究表明,外源NH4NO3的輸入顯著的促進(jìn)了土壤甲烷的產(chǎn)生速率,導(dǎo)致產(chǎn)生速率提高136.55%[21]. NO3-和NH4+的同時(shí)輸入在抑制甲烷氧化作用的同時(shí),會顯著促進(jìn)甲烷的產(chǎn)生,因此在密云水庫等淡水生態(tài)系統(tǒng)中,不同氮素形態(tài)的輸入對CH4氣體釋放的影響是不容忽視的.

圖6 密云水庫和北運(yùn)河MOB細(xì)菌與環(huán)境因子RDA分析

表5 MOB細(xì)菌群落組成與環(huán)境因子相關(guān)關(guān)系的Mantel檢驗(yàn)

注:*表示在0.05水平上顯著相關(guān). **表示在0.01水平上顯著相關(guān);其他無顯著相關(guān).

3 結(jié)論

3.1 密云水庫與北運(yùn)河沉積物中氮素的主要形態(tài)存在顯著差異,前者以NO3--N為主,后者以NH4+-N為主,均與兩個(gè)研究區(qū)水體中氮素的存在形態(tài)一致.

3.2 氮素形態(tài)的差異對MOB細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹和群落結(jié)構(gòu)有影響,兩研究區(qū)域中高同源性菌群的來源與其各自的氮素來源一致,水體中主導(dǎo)的氮素形態(tài)是MOB細(xì)菌的主要影響因子.

3.3 MOB細(xì)菌群落的共生關(guān)系受到水體污染程度的影響,重污染河流中微生物群落相互聯(lián)系更緊密,共生關(guān)系更趨于模塊化,微生物更脆弱,對環(huán)境變化的敏感程度更高,更容易受到水質(zhì)變化以及人類活動的干擾.

3.4 淡水環(huán)境中氮素的存在形態(tài)顯著影響了MOB細(xì)菌的群落分布.北運(yùn)河中高濃度的NH4+-N通過抑制甲烷氧化菌的氧化速率和促進(jìn)產(chǎn)甲烷速率的雙重作用影響河流甲烷的產(chǎn)生,密云水庫中NO3--N對甲烷氧化速率的抑制性低于北運(yùn)河中NH4+-N對甲烷氧化的抑制作用.

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Microbial communities differences between aerobic methanotrophs in Miyun Reservoir and North Canal.

LIU Yang1,2, CHEN Yong-juan1, WANG Xiao-yan1,3*, XU Kang-li1,Yang zhi-wei4

(1.College of Resources, Environment and Tourism, Capital Normal University,Beijing 100048, China；2.China Institute of Water Resources and Hydropower Research, Beijing, 100038, China；3.Research Center of Aquatic Environment in the Capital Region, Capital Normal University, Beijing 100048, China；4.Capital Normal University School of Life Sciences, Capital Normal University,Beijing 100048, China)., 2018,38(5)：1844~1854

The aerobic methanotrophs play an important role in mitigating methane emissions and promoting the carbon-nitrogen cycle in the freshwater ecosystems. In this study, the influences of different water pollutant on aerobic methanotrophs were analyzed between the Miyun Reservoir and the North Canal at the Beijing Metropolitan. The results showed that differences of physiochemical between Miyun Reservoir and the North Canal were significantly, especially the main form of nitrogen. The main form of nitrogen in Miyun Reservoir was NO3--N, while NH4+-N dominated in the North Canal. The physicochemical differences caused significantly influences on the MOB bacterial phylogenetic. Phylogenetic analyses revealed that the upstream freshwater highly contribute to the MOB sequences in Miyun Reservoir, and MOB has closely relationship with NO3--N. However, MOB sequences were mainly from activated sludge and wastewater in the North Canal, and MOB closely related with NH4+-N. The different form of nitrogen in these two ecosystems showed significant influences not only on the MOB serious, but also the sources of MOB. Furthermore, the MOB OTUs showed higher modular microbial network in the North Canal than the Miyun Reservoir. The tightly connected species of MOB communities indicated that bacterial community composition was more vulnerable and sensitive to the various disturbances in the North Canal. The different forms of nitrogen influenced the MOB oxidation and MOB inhibitant activity in different extent, the influence of NH4+-N on MOB was stronger than the influence of NO3--N on the Miyun Reservoir. The high concentration of NH4+-N in the city river that would not only inhibitant the MOB bacteria oxidation but also promote the CH4release.

sediment；aerobic methanotrophs；nitrogen；community structure；phylogeny；environmental factors；co-occurrence network

X172

A

1000-6923(2018)05-1844-11

2017-10-26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41271495);國家重大水專項(xiàng)(2009ZX07209-001-02)

* 責(zé)任作者, 教授, wangxy@cnu.edu.cn

劉 洋(1988-),女,山東棗莊人,首都師范大學(xué)碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究.發(fā)表論文9篇.