鄭 瑩,王亞娥,牟 彪

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具有鐵氧化功能的硝基苯降解菌的篩選及特性

鄭 瑩,王亞娥*,牟 彪

(蘭州交通大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

采用硝基苯(NB)模擬廢水對生物海綿鐵體系進(jìn)行馴化,篩選出一株具有鐵氧化功能的高效硝基苯降解菌Y-9.經(jīng)鑒定,菌株Y-9為節(jié)桿菌屬().通過平行對比實驗,考察了菌株Y-9適宜的生長條件,研究了菌株Y-9介入下的海綿鐵體系對NB的強化降解效果及降解機(jī)理.結(jié)果表明,菌株Y-9在硝基苯初始含量為200mg/L的條件下生長良好,且適宜的溫度為25~40℃,適宜的pH值為6~8.此外,菌株Y-9作用下的海綿鐵體系較單純海綿鐵體系及介入普通活性污泥的海綿鐵體系對硝基苯的降解率分別提高88.6%和32.2%.生物海綿鐵體系中Fe2+、H2O2、×OH含量明顯高于海綿鐵體系,尤其是鐵細(xì)菌Y-9作用下的生物海綿鐵體系,Fe2+、H2O2、×OH含量最高,為體系發(fā)生較強類Fenton效應(yīng)提供了條件.通過對降解產(chǎn)物的定量分析發(fā)現(xiàn),菌株Y-9降解硝基苯的途徑遵循部分還原途徑.本研究初步揭示了生物海綿鐵體系類Fenton效應(yīng)機(jī)理,為經(jīng)濟(jì)有效地處理硝基苯廢水提供了新思路.

硝基苯；降解；鐵氧化酶；海綿鐵

硝基苯(NB)具有較強的生物毒性被列于世界“環(huán)境優(yōu)先控制有毒有機(jī)污染物”名單前列[1].作為一種重要的有機(jī)原料中間體,被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)染料、炸藥、農(nóng)藥、醫(yī)藥等,每年大約有9000t NB通過工業(yè)廢水等方式進(jìn)入環(huán)境,造成水體、土壤和空氣等不同程度的污染[2-3].NB化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,苯環(huán)容易發(fā)生親電取代,不易發(fā)生氧化反應(yīng).目前[4-9],眾多學(xué)者的研究集中在采用高級氧化技術(shù)降解NB廢水.利用高活性的自由基,雖能在短時間內(nèi)將有機(jī)物完全礦化,但成本較高,易產(chǎn)生二次污染.研究表明,在Fe2+與微生物的混合體系中,鐵氧化菌大量繁殖[10].鐵氧化菌氧化Fe2+,并釋放一種特殊的酶,與過氧化氫酶一樣,能夠促進(jìn)H2O2形成[11],形成的H2O2與Fe2+可進(jìn)一步發(fā)生類Fenton反應(yīng)[12-13],從而促進(jìn)難降解有機(jī)物的降解[14].在Fe0體系中投加具有鐵氧化功能的NB降解菌處理NB廢水,既能利用微生物的新陳代謝作用降解NB, 又能通過生物腐蝕和電化學(xué)腐蝕促進(jìn)Fe2+的產(chǎn)生,從而使Fe2+與鐵氧化菌釋放的H2O2發(fā)生Fenton反應(yīng),進(jìn)一步強化降解NB.近年來, NB降解菌的研究主要包括藤黃微球菌()、叢毛單胞菌()、膠紅酵母()、鏈霉菌()和臭假單胞菌()等[15],且低溫或含鹽條件下NB降解菌的研究較多[16-20],而對于具有鐵氧化功能的NB降解菌鮮有報道.本研究利用NB對生物海綿鐵體系進(jìn)行馴化,富集分離得到7株具有鐵氧化功能的NB降解菌,通過NB降解率及鐵氧化酶活性的比較,篩選得到一株具有鐵氧化功能的高效NB降解菌,對其生長降解特性及主要影響因素進(jìn)行了研究.此外,將該高效菌富集培養(yǎng)成菌泥介入海綿鐵體系,通過與普通活性污泥海綿鐵體系對比,初步揭示了生物海綿鐵體系類Fenton效應(yīng)機(jī)理,為生物海綿鐵體系高效處理難降解有機(jī)物的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用Fe0為粒徑2~3mm的海綿鐵,使用前進(jìn)行預(yù)處理,即在1%硫酸中浸泡10min,期間不斷攪拌,取出后,用自來水沖洗數(shù)次,備用.接種污泥取自蘭州市安寧區(qū)污水處理廠二沉池.

1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L):Na2HPO4·12H2O 3.8; KH2PO41.0;NaCl1.0;MgSO4·7H2O0.2;pH值7.0~ 7.2.

Winogradsky鐵細(xì)菌培養(yǎng)基(g/L):NH4NO30.5; NaNO30.5; MgSO4·7H2O0.5; CaCl20.2; K2HPO40.5;檸檬酸鐵銨10;pH值7.2~7.4.

營養(yǎng)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10;牛肉膏3;NaCl 5;pH值7.4~7.6.

NB培養(yǎng)基:在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入200mg/ LNB; pH值7.0~7.2.

固體培養(yǎng)基:在上述培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂.

1.3 實驗廢水

1.2g/LNB儲備液:在1L棕色容量瓶中加入1mLNB原液,去離子水定容,封口膜封口,超聲至NB溶解.

100mL/L甲醇儲備液:10mL甲醇,去離子水定容至100mL.

NB模擬廢水:采用人工配水,以無機(jī)鹽溶液為主體,除馴化所用NB廢水外,其余配水以NB為唯一碳源.馴化所用NB廢水:逐漸減少甲醇儲備液的加量(5,3,2,1,0mL/L)同時逐漸增加NB儲備液的加量(16.7,33.3,66.8,133.3,166.7ml/L),配制成不同濃度(20,40,80,160,200mg/L) NB廢水.

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種的富集、馴化 將90g/L海綿鐵, 4g/L活性污泥加入有效容積為300mL的錐形瓶中,無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入20mg/LNB廢水,氣浴搖床震蕩培養(yǎng)(30℃,140r/min),周期為12h,換水比為1/2.培養(yǎng)一定時間至NB降解率達(dá)97%以上,提高NB濃度至40mg/L,此后不斷重復(fù)該過程至NB濃度達(dá)200mg/L,降解率為97%以上時,可認(rèn)為馴化完成.

1.4.2 菌種的分離篩選 將馴化完成的菌液涂布于Winogradsky鐵細(xì)菌固體培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)48h,挑取具有代表性的菌落,經(jīng)多次劃線,得到數(shù)株鐵細(xì)菌,再將得到的鐵細(xì)菌于以NB為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上不斷分離純化,得到7株具有鐵氧化功能的NB降解菌.

對分離所得的7株菌進(jìn)行NB降解能力及鐵氧化酶活性測定,從而得到1株具有鐵氧化功能的高效NB降解菌.

(1)NB降解能力測定

將篩選所得菌株分別培養(yǎng)成OD600相同的菌液,菌液投加量為10%,進(jìn)水NB濃度為200mg/L,于有效容積為100mL的錐形瓶中進(jìn)行NB降解實驗,30℃、140r/min培養(yǎng)60h,測定指定時間點各反應(yīng)器中NB濃度,比較各株菌對NB的降解效果.

(2)鐵氧化酶活性測定

將篩選所得菌株分別培養(yǎng)成OD600相同的菌液,取1mL接種到裝有9mLWinogradsky鐵細(xì)菌培養(yǎng)基的試管中,30℃培養(yǎng)5d得到發(fā)酵液.取8mL發(fā)酵液離心,離心后5mL上清液作為粗酶液測定酶活性.向5mL粗酶液中加入 FeSO4至200mg/L,30℃靜置30min后離心,按鄰菲羅啉法測定.

氧化率=[1-(OD平均值/OD空白值)]×100% (1)

相對酶活性=(氧化率/氧化率最高值)×100% (2)

式中:OD平均值為3個平行樣的平均值;OD空白值為3個未接菌平行樣的平均值;本文將測試組中氧化率最高者的相對酶活性定為100%.

1.4.3 高效菌的生長條件試驗 通過平行對比實驗,將處于對數(shù)生長期的菌液接種到NB濃度為200mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,140r/min恒溫振蕩培養(yǎng)60h后,測定NB剩余量及OD600.實驗控制單一變量(接種量10%,溫度30℃,pH值為7,改變其一),考察不同接種量(1%,5%,10%,15%,20%),不同溫度(10、15、20、25、30、35、40℃),不同pH值(4、5、6、7、8、9、10)對高效菌降解特性的影響.接種、離心和取樣等操作均在無菌條件下完成.

1.4.4 生物海綿鐵體系降解硝基苯試驗 將活化好的高效菌,接種至含200mg/LNB的滅菌Winogradsky鐵細(xì)菌培養(yǎng)基中,30℃,140r/min恒溫震蕩培養(yǎng),期間不斷補充營養(yǎng)物質(zhì),直至鐵細(xì)菌菌泥形成.

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入濃度為200mg/LNB作為實驗廢水,調(diào)節(jié)pH值至6.啟動三個有效容積為300mL的反應(yīng)器進(jìn)行平行對比實驗.1#反應(yīng)器投加60g/L海綿鐵;2#反應(yīng)器投加4g/LNB馴化完成的普通活性污泥,60g/L海綿鐵;3#反應(yīng)器投加4g/L鐵細(xì)菌菌泥,60g/L海綿鐵.30℃, 140r/min恒溫震蕩培養(yǎng),定點取樣,取樣間隔為1h,水樣經(jīng)0.22μm濾膜過濾后,測定其中NB、H2O2、Fe2+、×OH含量.每個反應(yīng)器設(shè)置兩組平行樣,取均值.

1.5 分析測定方法

NB濃度:高效液相色譜法.采用1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司),樣品過0.22μm有機(jī)濾膜后,收集到液相小瓶待測.測試條件:色譜柱C18(150mm′4.6mm,4μm),柱溫30℃,流動相:甲醇:水(:=70:30),等梯度淋洗,流速1.0mL/min,紫外檢測波長為265nm,自動進(jìn)樣,進(jìn)樣量10μL.

×OH:高效液相色譜法.取5mL水樣,加入2mL水楊酸(10mmol/L),去離子水定容至25mL,混勻,經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾,收集到液相小瓶后待測.測試條件:色譜柱C18(150mm′4.6mm, 4μm),柱溫30℃,流動相:甲醇:水(:=40:60),等梯度淋洗,流速1.0mL/min,紫外檢測波長為239nm,自動進(jìn)樣,進(jìn)樣量20μL.

細(xì)胞濃度(OD600):比濁法,在采用紫外分光光度計測定菌液在600nm下的光密度值.

鐵氧化酶活性參考相關(guān)文獻(xiàn)[21];H2O2:鈦鹽光度法[22];Fe2+濃度:鄰菲羅啉分光光度法.

2 結(jié)果與討論

2.1 降解菌的分離純化及降解特性研究

2.1.1 降解菌的分離純化 經(jīng)分離純化后得到具有鐵氧化功能的NB降解菌7株,其在含200mg/LNB的營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d的菌落形態(tài)特征如表1所示.

表1 降解菌的菌落特性

2.1.2 降解菌的降解特性及鐵氧化酶活性比較 對上述分離得到的7株菌進(jìn)行NB降解性能比較及鐵氧化酶活性比較,結(jié)果列于表2.

綜合比較各菌株60h對NB降解率、OD600及鐵氧化酶活性,選定Y-9為目標(biāo)菌株.經(jīng)16S rDNA鑒定,菌株Y-9為節(jié)桿菌屬(sp.).

表2 菌株的降解特性及鐵氧化酶活性比較

2.2 高效菌生長曲線

按10%的接種量將菌株Y-9接種于含200mg/LNB的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,30℃,140r/min恒溫震蕩培養(yǎng),研究菌株Y-9的生長曲線和NB的降解過程.結(jié)果見圖1.各點NB含量均已扣除NB的揮發(fā)量.

圖1 菌株Y-9的生長曲線和NB的降解情況

由圖1可知,20h內(nèi)菌株Y-9在適應(yīng)期,該階段微生物代謝系統(tǒng)要適應(yīng)新環(huán)境,同時需合成酶、輔酶等,微生物僅表現(xiàn)為個體增大,對NB降解緩慢;20~60h為菌株Y-9的對數(shù)生長期,此時菌體以幾何數(shù)增加,細(xì)胞代謝能力最強,大量NB被降解,60hNB降解率為61.4%,此后菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期,但由于營養(yǎng)的消耗使?fàn)I養(yǎng)物比例失調(diào)、有害代謝產(chǎn)物積累等理化條件變化,導(dǎo)致NB降解緩慢.

目前,被廣泛運用的描述生物群體在限制性條件下生長的數(shù)學(xué)模型是Monod方程和Logistic方程.Logistic方程以一定環(huán)境條件下所能達(dá)到的最大種群密度作為限制性因素,更易于操作.采用logistic 4參數(shù)擬合算法對菌株Y-9的生長曲線進(jìn)行擬合,以描述NB為唯一碳源時菌株的生長情況.

Logistic方程:

=2+ (1-2)/(1+(/0)) (3)

式中:為累計反應(yīng)時間;為某時間點微生物的光密度(OD600)值;1為OD600值的最小估值;2為OD600的最大估值;0為OD600max/2時的時間,亦是菌株增長速率最快的時間點;與0曲線斜率相關(guān).由圖1可知,logistic方程對菌株Y-9隨時間的生長變化曲線擬合度很高,相關(guān)性系數(shù)高達(dá)0.999,擬合方程為:=0.996-0.965/(1+(/ 40.39)6.24).易知,0=40.39,故取培養(yǎng)40h的Y-9菌液進(jìn)行實驗.

2.3 高效菌生長條件試驗

取培養(yǎng)40h,處于對數(shù)生長期(OD600=0.52)的Y-9菌液,接種于含有200mg/LNB的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,考察不同條件下,菌株Y-9對NB的降解效果.

2.3.1 接種量 接種量直接影響培養(yǎng)液中菌體的初始濃度.由圖2可知,菌株的生長速度和NB的降解能力隨接種量的增大而提高,但當(dāng)接種量增加到10%以上時對菌株的生長和降解能力影響較小,可能是此時菌種密度過大造成菌株處于貧營養(yǎng)狀態(tài),限制了菌株的生長代謝能力.因此,菌株Y-9的最適接種量為10%.

2.3.2 溫度 溫度是微生物生長繁殖重要的影響因子,它能夠影響微生物自身的酶催化反應(yīng)速度及基質(zhì)擴(kuò)散到細(xì)胞的速度.由圖3可知,菌株Y-9在10~15℃時,生長極其緩慢,對NB的去除率低于25%, 說明低溫抑制了鐵細(xì)菌Y-9的生長.25~40℃時生長良好,特別是30℃時,菌株生長最好,NB去除率在60%以上.Franzmann等[23]研究發(fā)現(xiàn),鐵細(xì)菌的活性與溫度密切相關(guān),且認(rèn)為絕大部分鐵細(xì)菌的最適生長溫度為30~50℃.由圖3可知,溫度高達(dá)40℃時,菌株Y-9對NB仍能保持較高去除率,對高溫環(huán)境有一定適應(yīng)性.

圖2 接種量對菌株Y-9生長和降解性能的影響

圖3 溫度對菌株Y-9生長和NB降解性能的影響

圖4 pH值對菌株Y-9生長和NB降解性能的影響

2.3.3 pH值 pH值與微生物的生命活動密切相關(guān),它不僅影響微生物的酶活性,還能影響微生物蛋白質(zhì)的解離,造成微生物細(xì)胞膜表面的電荷變化,從而影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,最終對微生物生長速率造成影響.此外,pH值對營養(yǎng)物質(zhì)的離子化和溶解度也有不同程度的影響.由圖4可知,pH值對菌株生長影響很大,過酸或過堿性均不利于菌株Y-9的生長.pH值為6~8時菌株生長良好,NB降解率均在60%以上.

2.4 生物海綿鐵體系降解NB試驗

由圖5可知,12h后,1#反應(yīng)器內(nèi)剩余177.3mg/LNB,去除率為11.4%,說明單獨的海綿鐵體系對NB具有一定的去除作用;2#反應(yīng)器對NB的降解作用較強,但12h后體系內(nèi)仍有64.5mg/LNB未被降解,去除率為67.8%;菌株Y-9(鐵細(xì)菌)作用下的3#反應(yīng)器能夠高效降解NB,12h可將濃度為200mg/L的NB完全降解,去除率遠(yuǎn)高出1#反應(yīng)器88.6%,且較2#反應(yīng)器高出32.2%.

研究表明[12-13],鐵細(xì)菌在氧化Fe2+的過程中會自主誘導(dǎo)胞外基質(zhì)中活性氧的產(chǎn)生,形成活性氧(ROS),進(jìn)一步誘發(fā)超氧化物、H2O2、×OH的產(chǎn)生,繼而發(fā)生類Fenton反應(yīng),能夠大大提高體系對難降解有機(jī)物的處理效果.為進(jìn)一步探究鐵細(xì)菌作用下海綿鐵體系高效降解NB的機(jī)理,測定每組反應(yīng)器內(nèi)Fe2+、H2O2、×OH含量,取均值對比.

圖5 生物海綿鐵體系對NB的降解效果

2.5 生物海綿鐵體系降解NB機(jī)理分析

由圖6可知,在初始pH值為6的條件下,1#海綿鐵體系與介入普通活性污泥的2#海綿鐵體系能夠產(chǎn)生少量活性氧化物,而鐵細(xì)菌存在的3#海綿鐵體系中,類Fenton效應(yīng)較為顯著,Fe2+、H2O2、×OH含量分別為8.4mg/L, 16.4mg/L, 0.2mg/L,遠(yuǎn)高于其他反應(yīng)器.

圖6 生物海綿鐵體系類Fenton效應(yīng)

研究表明[24-25],Fe0/O2體系在酸性條件下能夠發(fā)生類Fenton效應(yīng)(圖7),在海綿鐵體系中可檢測出少量Fe2+、H2O2及×OH.但隨著Fe2+與H+的消耗,pH值升高,類Fenton反應(yīng)停止,體系中NB也不再降低.微生物的加入,促進(jìn)了海綿鐵腐蝕,Fe2+濃度升高.尤其是鐵細(xì)菌的存在,不僅能夠誘發(fā)超氧化物、H2O2、×OH的產(chǎn)生,且在氧化Fe2+的過程中產(chǎn)生大量的H+[11],促進(jìn)了類Fenton效應(yīng)的發(fā)生,提高了NB降解效果.

圖7 Fe0/O2體系類Fenton效應(yīng)

Nishino等[26-27]研究發(fā)現(xiàn),微生物對NB的降解存在2種途徑,部分還原途徑和氧化降解途徑.環(huán)境中大部分微生物降解NB遵循部分還原途徑[28],降解機(jī)理如圖8所示[26].從圖8可知,NB先還原成苯胲,再進(jìn)一步還原成鄰羥基苯胺,開環(huán)降解,脫去的氨基全部轉(zhuǎn)化成為NH3.部分還原途徑以氨氮的積累為代表[26],而氧化降解途徑則脫去NO2-,亞硝酸鹽積累[27].

圖8 NB部分還原降解途徑

為進(jìn)一步探究生物海綿鐵體系對NB的降解途徑,在反應(yīng)初期、中期和末期對3#鐵細(xì)菌體系NB降解過程中的氮素進(jìn)行測定.結(jié)果表明,鐵細(xì)菌存在的海綿鐵體系在降解NB的過程中,僅存在氨氮的積累.理論上,200mg/L的NB通過部分還原途徑被微生物完全降解,可產(chǎn)生27.6mg/L氨氮.該體系12h完全降解200mg/LNB產(chǎn)生了26.94mg/L氨氮,氮素的轉(zhuǎn)化率為97.6%,其他極少部分氮素可能被菌株Y-9直接利用合成自身物質(zhì).因此,菌株Y-9降解NB的途徑為部分還原途徑.

3 結(jié)論

3.1 采用模擬NB廢水對生物海綿鐵體系進(jìn)行馴化,得到大量具有鐵氧化功能的NB降解菌.通過鐵氧化酶活性及NB降解效果的比較,篩選出一株具有鐵氧化功能的硝基苯高效降解菌Y-9. 經(jīng)鑒定,菌株Y-9為節(jié)桿菌屬().該菌株在NB初始含量為200mg/L的條件下生長良好,且適宜的溫度為25~40℃,適宜的pH值為6~8.

3.2 鐵細(xì)菌介入的海綿鐵體系對NB具有良好的處理效果,12h可將200mg/L的NB完全降解,較單純海綿鐵體系及活性污泥介入的海綿鐵體系分別提高88.6%和32.2%.

3.3 通過對不同體系降解機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn),生物海綿鐵體系中Fe2+、H2O2、×OH含量明顯高于海綿鐵體系,尤其是介入鐵細(xì)菌Y-9的生物海綿鐵體系,Fe2+、H2O2、×OH含量更高,為體系發(fā)生較強類Fenton效應(yīng)提供了條件.通過對降解產(chǎn)物的定量分析發(fā)現(xiàn),菌株Y-9對NB的降解遵循部分還原途徑.

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Screening and degradation characteristics of nitrobenzene-degrading bacterium with iron oxidation function.

ZHENG Ying, WANG Ya-e*, MU Biao

(School of Environmental and Municipal Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China)., 2018,38(5)：1837~1843

An efficient iron bacterium used to degrade nitrobenzene (NB) was isolated from the biological sponge iron system domesticated through NB simulated wastewater. The strain was identified assp. The suitable growing conditions, as well as the degradation effect and mechanism in sponge iron system with strain Y-9, were carried out by the contrast experiments. Results indicated that strain Y-9 grew well when the initial concentration of NB was 200mg/L, and the optimal conditions for the biodegradation of NB by strain Y-9 were at 25~40℃ and pH 6~8. Besides, in contrast with the normal sponge irons system and the sponge irons system involved in ordinary activated sludge, the degradation rate of NB in biological sponge irons system at the present of strain Y-9 increased by 88.6% and 32.2%, respectively. The concentration of Fe2+, H2O2, and ·OH in the biological sponge iron system, especially the system inoculated with strain Y-9, were significantly higher than that of normal sponge iron system, thus, it could promote Fenton-like effect. Quantitative analysis of the degradation products revealed that strain Y-9 followed the partial reductive degradation pathway of NB. The research revealed the mechanism of Fenton-like effect in a biological sponge iron system, and it also provided a new way to treat NB wastewater effectively.

nitrobenzene；degradation；ferroxidase；sponge iron

X172

A

1000-6923(2018)05-1837-07

2017-09-29

國家自然科學(xué)基金資助項目(51468030)

, 教授, wye@ mail.lzjtu.cn

鄭 瑩(1993-),女,江西宜春人,蘭州交通大學(xué)碩士研究生,研究方向為水污染控制.