文│曹民川 周麗梅 唐振興（陜西省銅川市動物疫病預(yù)防控制中心）

本研究以陜西省銅川市某養(yǎng)殖場疑似肉雞大腸桿菌病的病雞為研究對象，采集其肝臟、脾臟等組織作為病料，進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)以及生化鑒定、血清型鑒定，并進(jìn)一步進(jìn)行了藥敏試驗。試驗結(jié)果表明，分離獲取的40株分離株均為大腸桿菌，分離率為66.67%，其血清型分別為O78（10株）、O2（8株）、O8（6株）、O143（4株）、O1（3株）、O35（2株）。藥敏試驗結(jié)果顯示：分離株對環(huán)丙沙星高敏；對卡那霉素、紅霉素中敏；對青霉素、鏈霉素、慶大霉素低敏。因此，環(huán)丙沙星可以作為該養(yǎng)雞場預(yù)防和治療雞大腸桿菌病的藥物，其他抗生素可以減少其使用量或停用。

當(dāng)機(jī)體的抵抗力下降或者外界的環(huán)境發(fā)生改變有一部分大腸桿菌成為致病菌株，達(dá)到了致病性大腸桿菌生長發(fā)育的條件，大腸桿菌數(shù)量增多，就會乘虛而入侵入動物腸道內(nèi)并在合適的位置定居，生長繁殖。臨床上以出現(xiàn)心包炎、肝周炎、氣囊炎、輸卵管炎、眼球炎及肉芽腫、敗血癥等為特征。大腸桿菌可以通過飼料、水、空氣等進(jìn)行傳播，也可以垂直傳播但容易造成死胚、弱雛增多，使養(yǎng)禽業(yè)受到打擊。大腸桿菌病是養(yǎng)雞業(yè)最嚴(yán)重的常見多發(fā)病，尤其是3～6周齡的雛雞容易感染，且在臨床中多以混合感染，從而難以治愈，發(fā)病率高，死亡率逐步增加。該病的傳染性強(qiáng)，傳播范圍廣，因為大腸桿菌的血清型比較復(fù)雜，目前沒有有效的疫苗可以預(yù)防。因此，該病一直以來主要用藥物來進(jìn)行防治，這使得耐藥性越來越嚴(yán)重，給治療帶來一定的難度。

大腸桿菌生長的環(huán)境簡單，營養(yǎng)的要求低，在一般的營養(yǎng)培養(yǎng)基上即可成長，溫度在15～45℃，菌落直徑2～3毫米，圓形，表面濕潤光滑。該菌對理化要素較敏感，60℃25分鐘或55℃1小時即可致死，121℃經(jīng)高壓滅菌迅速死亡。該菌對自然因素抵抗力較強(qiáng)，可在水中生存百余天，在糞便中能生存200多天，在飼料、墊草，中也可長期生存。大腸桿菌對甲醛、漂白粉敏感，但是如果存在糞便以及黏液，會很大一部分降低這些消毒劑的成效。多數(shù)禽類對大腸桿菌較為敏感，并且在感染后病情會加重，雛雞極易發(fā)生氣囊炎。感染大腸桿菌的肉雞表現(xiàn)精神萎靡，體溫呈上升趨勢，食欲減少，消瘦和下痢，全身無力，羽毛變得疏松，呆立，伸頸閉眼，行動緩慢，其中糞便里混有少量黏液，經(jīng)常導(dǎo)致肛門周圍的羽毛受到污染。情況嚴(yán)重的病雞腹部出現(xiàn)高度腫大，觸摸敏感并伴有波動，病程能夠持續(xù)兩個星期或更長。

治療大腸桿菌病首先應(yīng)該改善飼養(yǎng)環(huán)境，及時清除雞糞，提高室溫，改善雞舍通風(fēng)的狀況，利用百毒殺每天帶雞噴霧消毒2次，連續(xù)使用7天?？墒褂昧蛩峥敲顾?，按70毫克/千克體重的用量，2次/日，肌肉注射，連續(xù)使用3天，用藥2天后雞群采食量增加，癥狀開始出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，5天后雞群開始恢復(fù)正常。

本研究對疑似肉雞大腸桿菌病的病雞采集其肝臟、脾臟作為病料，進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)、血清型鑒定、藥敏試驗，為臨床治療肉雞大腸桿菌病提供了參考。

一、材料與方法

1.材料。

（1）病料。取自銅川市某養(yǎng)殖場中疑似患有大腸桿菌病的病雞，60只，3～6周齡。

（2）培養(yǎng)基。肉湯培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基，普通瓊脂培養(yǎng)基。

（3）標(biāo)準(zhǔn)O型分型血清。單因子大腸桿菌血清（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）。

（4）主要儀器和設(shè)備。恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、高壓蒸汽滅菌鍋（山東新華醫(yī)療機(jī)械有限公司）、光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯、濟(jì)南）。

2.方法。

（1）臨床檢查。觀察病雞的精神狀態(tài)、飲欲、食欲和雞的羽毛色澤，用手觸摸，給予適當(dāng)?shù)拇碳び^察雞的反應(yīng)。觀察病雞產(chǎn)蛋的情況、排泄物的黏稠程度，糞便顏色，有沒有惡臭，并且查閱最近兩周內(nèi)雞群的采食量的記錄。

（2）剖檢。首先仔細(xì)觀察病雞的表面狀況，包括雞冠和皮膚、鼻腔和嘴的分泌物及排泄物的性狀、顏色，然后打開胸腔、腹腔，觀察有無積液，觀察黏膜、氣囊的變化，各內(nèi)臟器官有無出血等病變，并無菌采集病死雞的肝臟、脾臟作為病料。

（3）病原菌的分離培養(yǎng)與純化。在無菌條件下取病雞的肝組織，脾臟組織等接種于肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃恒溫的培養(yǎng)箱培養(yǎng)23～24小時，觀察結(jié)果。

（4）生化試驗。選取麥康凱培養(yǎng)基上單一紅色菌落于營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)17小時后，取適量的菌液，分別接種于葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘露醇、山梨醇、硫化氫、肌醇、尿素、V.P試驗，37℃培養(yǎng)24～48小時，觀察結(jié)果。

（5）血清型鑒定?？乖闹苽洹Ｖ苽涓邏嚎乖涸谄胀ǖ沫傊泵嫫桨迳弦约肮┐竽c桿菌生長的肉湯小管里接種來自麥康凱培養(yǎng)基上接種被檢的菌株，其中被檢菌株放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時，在麥康凱培養(yǎng)基上形成典型的、單個的小紅色菌落，進(jìn)行分別接種，接種后在37℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)24小時，其中普通肉湯小管為液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)期間需要震蕩。然后用約3毫升的0.5%石碳酸生理鹽水沖洗瓊脂斜面培養(yǎng)物，放置試管中，并與普通肉湯小管培養(yǎng)物一起放到121℃高壓中2小時，破壞K抗原。

玻板凝集反應(yīng)。將高壓抗原和血清分別取8毫升放到玻板上混合均勻，在2～4分鐘內(nèi)呈現(xiàn)明顯的凝集則為陽性反應(yīng)。

（6）藥敏試驗。打開超凈工作臺，點(diǎn)燃酒精燈，將接種環(huán)在酒精燈上來回灼燒進(jìn)行滅菌，然后挑取細(xì)菌培養(yǎng)物，將菌液均勻的涂布到平皿中。然后用無菌的鑷子夾起藥敏紙片放到固體培養(yǎng)基上面并輕輕按壓，使藥敏紙片與培養(yǎng)基表面全部接觸。為了能夠精確察看結(jié)果，藥敏紙片位置安放適中，避免出現(xiàn)抑菌圈重疊。20分鐘后再置于37℃溫箱中培養(yǎng)18～24小時，觀察結(jié)果。

二、結(jié)果

1.臨床檢查結(jié)果。病雞精神萎靡，咳嗽，呼吸困難，羽毛疏松，飲欲變大，食欲減小，用手觸摸，能感受到病雞畏寒發(fā)抖，給予適當(dāng)?shù)拇碳ぃ‰u反應(yīng)停滯；產(chǎn)蛋率下降，蛋小、蛋殼粗糙；排黃綠色的稀糞，有酸臭味。

表1 分離細(xì)菌生化試驗結(jié)果

◎圖1 分離菌菌落形態(tài)（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）

◎圖2 分離菌菌落形態(tài)（麥康凱培養(yǎng)基）

2.剖檢變化。病雞的雞冠出現(xiàn)暗紫色，皮膚外表顏色暗淡、無光澤，鼻分泌物增加；解剖病雞可見腹腔內(nèi)有大量的腹水；直腸腸管的黏膜以及泄殖腔黏膜呈現(xiàn)彌漫性的針尖狀出血，氣囊變厚，出現(xiàn)混濁；肝臟變得腫大，外表籠罩一層點(diǎn)狀黃白色纖維性膜，表面有大小不等的壞死斑。

表2 40株分離菌血清型鑒定結(jié)果

表3 大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果

3.病原菌的分離與純化。待分離菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長24小時后，形成乳白色菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上形成紅色菌落，如圖1、圖2。分離菌經(jīng)過涂片、染色、鏡檢，形成革蘭染色陰性短粗桿菌無可見的莢膜，具有典型的大腸桿菌的染色特及形態(tài)，如圖3。

4.生化試驗結(jié)果。從分離培養(yǎng)的細(xì)菌中，挑取典型的菌落，使用馬丁湯培養(yǎng)，用常規(guī)方法進(jìn)行生化試驗，結(jié)果見表1。

5.血清型鑒定結(jié)果。對銅川市某養(yǎng)殖場送檢的60份病料，經(jīng)鑒別分離出40株肉雞源大腸桿菌菌株，分離率為66.67 %。其中40株肉雞源大腸桿菌中有33株鑒定出O血清型，占分離菌株的82.50 %；7株未定型，占分離菌株的17.50%。鑒定出的33株大腸桿菌O血清型分別為O78（10株）、O2（8株）、O8（6株）、O143（4株）、O1（3株）、O35（2株），其中主要的血清型為O78、O2、O8三種，占分離菌株總數(shù)的72.73 %，結(jié)果見表2。

6.藥敏試驗結(jié)果。結(jié)果顯示，環(huán)丙沙星對大腸桿菌的敏感性較高；卡那霉素、紅霉素對大腸桿菌的敏感性一般；青霉素、鏈霉素、慶大霉素對大腸桿菌的敏感性較低；說明環(huán)丙沙星作為治療該病首選藥物。具體結(jié)果見表3。

三、討論

本研究通過對銅川市的40株肉雞源致病性大腸桿菌分離菌株的血清型鑒定結(jié)果可以知道O78、O2、O8等菌株出現(xiàn)的頻率很高，這與國內(nèi)外研究報道的O78和O35禽致病性大腸桿菌常見血清型基本相符。

本研究分離鑒定出40株肉雞源大腸桿菌菌株，分離率為66.67%，分離率較高，表明大腸桿菌病在該地區(qū)發(fā)生頻繁，是養(yǎng)殖業(yè)中常見病之一。通過分析我們可以知道，該病的發(fā)生與多種因素有關(guān)，如飼養(yǎng)管理不當(dāng)、營養(yǎng)失衡、疫苗接種所產(chǎn)生的應(yīng)激、天氣惡劣或繼發(fā)于其他的疾病等。該病多以混合感染的形式出現(xiàn)，大腸桿菌病產(chǎn)生的概率也越來越高，治療也越來越困難，目前大腸桿菌病已居于細(xì)菌性疾病之首。現(xiàn)在，如果只是單一防治大腸桿菌病已經(jīng)難以收到理想的效果，與此同時應(yīng)該消除其他可能性的致病因素。在已經(jīng)出現(xiàn)耐藥性的雞場尤其是高發(fā)地區(qū)，最好能進(jìn)行大腸桿菌的藥敏試驗，篩選出高敏藥物，制訂出合理的給藥計劃，配合環(huán)境消毒，改善飼養(yǎng)管理的條件，從而達(dá)到理想的治療效果。

目前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展速度非?？欤?xì)菌的耐藥性問題也越來越受到人們的關(guān)注。林居純等2009年對來自我國不同地區(qū)的588株大腸桿菌進(jìn)行耐藥性檢測，結(jié)果顯示禽源大腸桿菌的多重耐藥性現(xiàn)象非常嚴(yán)重，禽源菌株占95.12%。

◎圖3 分離菌在顯微鏡下的形態(tài)（×100）

隨著大腸桿菌耐藥菌株不斷增加，肉雞大腸桿菌病的有效防治也越來越難，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)健康發(fā)展。細(xì)菌的耐藥性是可以通過質(zhì)粒的接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，威脅人類的身體健康。因此，我們需要尋找有效、能夠延緩和減少細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的治療方法。首先，我們應(yīng)該學(xué)會科學(xué)適當(dāng)?shù)酿B(yǎng)殖、防止過度濫用藥物；條件好的養(yǎng)殖場應(yīng)該通過藥敏試驗來選擇用藥；優(yōu)化飼養(yǎng)管理的方式，減少大腸桿菌病的發(fā)生。