王 楊,李 祎,彭傳梅,張 勝,陳婉婷,衛(wèi) 波,高 輝

(昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院 檢驗科,云南 昆明650051)

手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)是一種常見的由腸道病毒引起的兒童感染性疾病。EV71(enterovirus 71,EV71)是引起兒童手足口病的常見病原體之一[1]。EV71感染?？梢饑乐氐闹袠猩窠浵到y(tǒng)并發(fā)癥,如急性腦炎、麻痹性癱瘓、腦脊髓炎等,易發(fā)生于小于5歲的兒童[2,3]。

EV71屬于小核糖核酸病毒科家族腸道病毒屬,由單股正鏈RNA基因組(約7.4 kb)構成的一種無包膜病毒,其中編碼的VP1是處于最外圍的免疫原性蛋白,是主要的病毒致病因素,在病毒感染的吸附和脫殼過程中發(fā)揮重要作用[3,4],且包含主要的中和表位,可用于病毒的鑒定和進化分析[5]。本研究選取了EV71的VP1基因進行臨床研究,旨在豐富本地區(qū)HFMD的遺傳基因數(shù)據(jù)庫,為探究HFMD流行的分子遺傳致病機制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1研究對象收集2015年1月至2016年12月期間在昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院臨床就診疑似手足口病患者590例,其中男性355例,女性235例,年齡0-36歲,≤5歲470例,5歲至18歲118例,≥18歲2例。疑似患者主要因手掌、足部及口腔等部位出現(xiàn)皰疹為首發(fā)癥狀或者伴隨發(fā)熱、腹瀉等就診于皮膚科及兒科等臨床科室。

1.2標本采集及保存參照中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布的《手足口病預防控制指南(2008年版)》[6]。在研究對象知情同意的原則下,采集HFMD患者發(fā)病7日內的糞便標本,用于病原檢測。

1.3試劑、儀器

腸道病毒71型(EV71)核酸檢測試劑盒(江蘇默樂生物科技有限公司)；核酸提取試劑盒(離心柱法)(中山大學達安基因股份有限公司)；逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTM RT-PCR Kit) (日本TaKaRa公司)；上下游引物P1、P2 及DNA Marker(北京博邁德生物技術有限公司)；熒光定量PCR儀(ABI StepOne)。

1.4實驗方法

1.4.1EV71的熒光PCR檢測 對疑似病例臨床糞便樣本進行病毒核酸提取,實時熒光PCR法檢測病原體EV71,具體操作步驟根據(jù)試劑盒操作說明書，PCR循環(huán)參數(shù)設定見表1。

表1 PCR循環(huán)參數(shù)

熒光信號數(shù)據(jù)的采集定在60℃。

1.4.2逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)

(1) 提取EV71陽性樣本中的病毒RNA作為模板進行RT-PCR反應。反應液比例見表2。

(2) 將配好的反應液放入PCR儀中,65℃反應5 min后,取出迅速放置冰上待用。

(3) 配置RT-PCR反應體系,具體比例見表3。

(4) 將配好的RT-PCR反應體系放入PCR儀中,循環(huán)參數(shù)為：37℃ 15 min,50℃ 15 min,65℃ 10 min。

表2 反應液配置比例

表3 RT-PCR反應體系

1.4.3PCR反應擴增VPl目的基因

(1) 引物設計 用Primer Premier 5.0軟件自行設計EV71 VPl基因引物,由北京博邁德科技發(fā)展有限公司進行引物合成,引物序列見表4。

表4 PCR引物序列

(2) PCR 反應 整個PCR反應體系50.0 μl,包含以下成分：cDNA 模板 2.0 μl、30pmol 正、反向引物各1.0 μl、10XeasyTaq DNA 緩沖液 5.0 μl、5 U/μl EasyTaq DNA 聚合酶 0.5 μl、2.5 mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷(dNTPs)混合物5.0 μl、無RNA酶純水35.5 μl。反應條件為：94℃3.0 min ,1個循環(huán)；94℃3.0 min,56℃0.5 min,72℃1.0 min,35個循環(huán)；72℃3.0 min,1個循環(huán)。擴增產物進行瓊脂糖電泳鑒定。

1.4.4VPl基因擴增產物測序 全部陽性擴增產物送北京博邁德科技發(fā)展有限公司測序。

1.4.5構建系統(tǒng)發(fā)育樹 測序結果與GenBank中EV71相關參考毒株序列進行比對,應用DNAMAN(5.1.0.0)軟件(美國Lynnon Biosoft公司)進行同源性分析。用MEGA 4.0 軟件(http://www.megasoftware.net/)鄰接法(neighbour-joining)和Kimura 2-parameter模型構建種系遺傳進化發(fā)育樹。

2 結果

2.1檢出情況2015年1月至2016年12月在昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院就診的590例疑似手足口病患者中實驗室檢查共檢出EV71型50例,檢出率為8.47%(50/590例),其中2015年檢出28例,2016年檢出22例。50例中≤5歲35例,5-18歲13例,≥18歲2例；男性占64.00%(32/50例),女性36.00%(18/50例),女性患者中包括2例成人HFMD患者。

2.2PCR擴增產物電泳結果50例EV71陽性樣本經PCR擴增VP1基因,通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定,陽性擴增產物顯示為1 200 bp,見圖1。

圖1 Lane 1:DNA Marker Lane 2:陽性對照EV71的VP1擴增產物 Lane 3:樣本EV71的VP1陽性擴增產物

2.3EV71VPl基因序列比對分析50株EV71的VPl基因測序結果與GeneBank中EV71參考毒株(KU936121.1)進行序列的比對,得出同源性為97.96%-99.43%,確定檢出毒株均為EV71型C4亞型。

2.4EV71VPl基因親緣性關系樹分析選出50株EV71中同源性小于99%的15株毒株(2015年：編號EV71-VP1-1145-1147、-1149、-1151、-1153、-1159、-1161、-1248；2016年：編號EV71-VP1-2732、-2740、-2742、-2746、-2756、-2760、-2762)。與GenBank中EV71相關參考毒株序列比較,進化樹分析顯示,本研究中檢出毒株與北京(編號：EV71 strain BJ4211 VP1)、合肥(編號：EV71 isolate 1401-Luan(CHN)-08 VP1；EV71 isolate 1404-Luan(CHN)-08 VP1)以及馬來西亞流行毒株(編號：EV71 isolate SB12007-SAR-03 VP1；EV71 isolate SB12278-SAR-03 VP1；EV71 isolate SB10712-SAR-03 VP1)共處于同一進化譜系,遺傳距離較近(0.026)。與寧波(編號：EV71 strain EV71/Ningbo.CHN/001/2010)、上海(編號：EV71 strain SHAPHC5251/SH/CHN/14)、深圳(編號：EV71 isolate EV71/SZ07/CHN/2014；EV71 isolate EV71/SZ88/CHN/2014)、溫州(編號：EV71 isolate EV71/P156/2013/China；EV71 isolate EV71/P654/2013/China；EV71 strain 15/EV71/Wenzhou/CHN/2014)等地區(qū)分離的EV71流行毒株遺傳距離較遠(1.52)。而與澳大利亞(編號：EV71 strain 2978-SYD-92 VP1；EV71 strain 7784-SYD-90 VP1；EV71 strain 1182-SYD-91 VP1； EV71 strain 6560-SYD-86 VP1)的分離毒株遺傳距離最遠(2.11)。

3 討論

HFMD是由多種人腸道病毒引起的兒童常見傳染病,已納入我國法定報告的丙類傳染病。HFMD易發(fā)生于學齡前兒童,但成人亦可見,隨著環(huán)境的變化、病原體的基因變異及人群中隱性感染者的大量存在,成人HFMD的患病率可能呈現(xiàn)上升趨勢[7]。HFMD在東南亞地區(qū)曾引起廣泛的流行,包括中國臺灣和大陸、新加坡、馬來西亞與日本等地,中國大陸首次報道是上海(1981年)[8,9]。

本研究中EV71檢出率為8.47%(50/590)。50例中男性32例,女性18例。女性患者中有2例為成人,成人HFMD的發(fā)生率較低,成人女性有病毒感染的易感性,符合相關的文獻報道[10]。有學者認為思想壓力大、精神緊張、身體疲勞、營養(yǎng)不良所致自身免疫力低下,同時與HFMD患者密切接觸,是引起成人HFMD的發(fā)病的重要因素[11]。成人可感染HFMD,并易造成家庭成員聚集性感染與交叉混合感染,且成人存在隱性感染,傳染性及危害性很大,不容忽視,近年對成人重癥HFMD和發(fā)展嚴重并發(fā)癥的情況均時有報道[12],因此在HFMD高發(fā)時節(jié)要注意成人的感染流行。

EV71分為3種基因型,分別是A、B和C型,其中B型和C型可再劃分為B1-B5亞型,C1-C5亞型；最新研究已發(fā)現(xiàn)在印度、香港及非洲地區(qū)分離出EV71的D型、E與F型基因亞型[13]。

本研究顯示,2015-2016年2年間檢出的50株昆明地區(qū)散發(fā)流行的HFMD病原體EV7l均為C4亞型,與2011年符宗敏等[14]在云南昆明地區(qū)分離的EV71毒株屬于同一亞型。50株EV7l同屬于C4亞型,遺傳進化分析均處于同一分支上,說明毒株有相近的起源,2年間未發(fā)生大的基因遺傳變異；但是從構建的親緣關系樹上仍可以看出一些差異,EV7l毒株呈現(xiàn)出時間聚集性,同一年份檢出的毒株遺傳距離相對更近,EV7l毒力變異可能是導致本地區(qū)持續(xù)每年均有感染患病、散發(fā)流行的重要因素之一。EV7l型毒株與馬來西亞沙撈越州地區(qū)所流行分離的EV71毒株同源性最高,可能與云南昆明地處中國西南地區(qū),相對臨近該國家地區(qū),可能因經濟貿易、旅游等交流環(huán)節(jié)中導致HFMD病原體EV7l的傳播流行,所以在HFMD流行的高發(fā)時節(jié)應加強人員出入境安全監(jiān)測、防護,杜絕外來患者作為傳染源流入境內,避免更廣泛、嚴重的感染流行。

作者簡介：王楊(1974-),女,碩士,主要從事臨床分子生物學檢驗研究。

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