張永科，法萍萍，謝 君，王 賀，陳 靜，桂耀庭

(1.北京大學深圳醫(yī)院 婦產科，廣東 深圳518036；2.深圳市女性重大疾病早期診斷技術重點實驗室，廣東 深圳518036；3.深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院 輸血科，廣東 深圳518000；4.北京大學深圳醫(yī)院 廣東省男性生殖與遺傳重點實驗室，廣東 深圳518036；5.北京大學深圳醫(yī)院 檢驗科，廣東 深圳518036)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的關于不育的診斷標準——經過至少12個月沒有避孕的性生活而沒使配偶懷孕，育齡夫婦不育的發(fā)生率約為10%-15%。研究表明，50%以上的不育夫婦中，男性存在生殖功能缺陷[1,2]。臨床上男性不育的原因大體可分為四類：生精障礙、輸精管道梗阻、性腺附屬器官異常及性功能異常，其中又以精子發(fā)生障礙最為常見[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，遺傳因素所導致的精子發(fā)生障礙占有較大比例，染色體異常和Y染色體無精子癥因子(azoospermia factor，AZF)微缺失是重要的致病原因[2,4]。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2009年3月-2014年4月在北京大學深圳醫(yī)院泌尿外科或生殖醫(yī)學中心就診治療的無精子癥患者490例及嚴重少精子癥患者196例，所有樣本嚴格按照《世界衛(wèi)生組織男性不育標準化檢查與診療手冊》的要求排除了如下情況：最近6個月內高熱史；泌尿生殖道畸形；接受泌尿生殖系統(tǒng)手術史；泌尿系統(tǒng)感染史；性傳播疾病感染史；附睪炎史；睪丸損傷(睪丸炎、外傷、扭轉等)病史；精索靜脈曲張；睪丸下降不全或隱睪；性功能及射精功能異常；其他可能的影響因素如慢性病史(如糖尿病、結核、慢性呼吸系統(tǒng)疾病、胰腺囊性纖維化等)、高溫毒性工作環(huán)境及酗酒、吸毒、嗜煙等不良生活習慣等[6]。按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊(第五版)》的診斷標準[7]，進行至少2次精液常規(guī)分析，共收集到無精子癥患者490例，嚴重少精子癥患者196例，選取115例12個月內致女方受孕且精液質量正常的健康男性為對照組。

1.2 方法

1.2.1精液分析

受檢者禁欲2-7天，手淫法采集精液標本(向受檢者充分說明采集方法，保證標本完整性，精液采集容器已證實相容性)，計算機輔助精液分析參照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊(第五版)》的要求進行[7]：所有受檢者均常規(guī)進行至少2次精液分析檢查，對鏡檢未發(fā)現(xiàn)精子的受檢者精液3 000 g離心15min沉淀后仍未發(fā)現(xiàn)精子者(經3次離心沉淀分析)定義為無精子癥；精子濃度<5×106/ml時為嚴重少精子癥。

1.2.2外周血培養(yǎng)細胞染色體核型分析

利用傳統(tǒng)外周血染色體制備方法進行細胞培養(yǎng)、染色體制備及核型分析，G顯帶計數(shù)20個中期分裂象，分析3個細胞核型，異常核型相應增加分析數(shù)目，根據(jù)《人類細胞遺傳學國際命名體制》(ISCN 2009)的共識描述染色體異常核型[8]。

1.2.3Y染色體微缺失檢測

采用亞能生物技術(深圳)有限公司全血DNA快速提取試劑盒從EDTA抗凝全血中提取基因組DNA。Y染色體微缺失檢測使用亞能生物Y染色體微缺失快速檢測試劑盒進行分析，該試劑盒利用多重PCR特異性擴增AZF區(qū)的15個序列標簽位點(STSs)，以Y染色體性別決定區(qū)SRY基因為內對照，涵蓋歐洲生殖學會推薦檢測位點，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，所有步驟均按照相關說明書進行操作。

1.2.4統(tǒng)計學方法

利用SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析，使用t檢驗和卡方檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 染色體異常核型檢出率及分布

490例無精子癥患者共檢出染色體多態(tài)性49例(10%)、異常核型30例(6.12%)(表1)。染色體多態(tài)性中Y染色體多態(tài)性17例，包括Yqh+ 5例(1.02%)、Yqh- 12例(2.45%)。染色體異常核型包括染色體數(shù)目異常15例(3.06%)，其中克氏綜合癥8例(1.63%，包括1例嵌合型)，染色體結構畸形15例(3.06%)。196例嚴重少精子癥患者共檢出染色體多態(tài)性15例(7.65%)，其中Y染色體多態(tài)性7例(3.57%)，檢出染色體結構異常4例(2.04%)，未檢出染色體數(shù)目異常。115例對照組共檢出染色體多態(tài)性15例(13.04%)，3組間染色體異常核型檢出率有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01),未發(fā)現(xiàn)染色體多態(tài)性(尤其是Y染色體多態(tài)性)存在統(tǒng)計學差異。

2.2 Y染色體微缺失分析

如表2所示，共檢出8種Y染色體微缺失類型，其中AZFc+d缺失最常見，缺失率無精子癥患者為10.41%，嚴重少精子癥患者為9.18%。共檢出70例無精子癥患者存在Y染色體微缺失，總的缺失率為14.29%；22例嚴重少精子癥患者存在Y染色體微缺失，總的缺失率為11.22%，對照組未檢出Y染色體微缺失。結果提示三組間Y染色體微缺失檢出率存在顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

3 討論

3.1 性染色體異常是引起男性生精障礙的重要原因

精子發(fā)生(spermatogenesis)是有性生殖的雄性動物的睪丸中，生殖細胞從精原細胞一直發(fā)育到成熟精子的過程。該過程已知受Y染色體上相關基因的影響[9]。Y染色體性別決定區(qū)(sex-determining region of Y-chromosome，SRY)是人體Y染色體短臂末端上的一段基因片段，該基因是決定男性睪丸發(fā)育的主要基因，目前認為，SRY基因就是唯一一個性別決定基因[10]。核型為46,XX的女性不能生成睪丸從而不能形成精子，特殊情況下，46,XX男性能生成睪丸但睪丸嚴重發(fā)育不良亦不能形成成熟精子。由此可知，精子發(fā)生還需要Y染色體上其他基因的參與[11,12]?？耸暇C合征(Klinefelter's Syndrome)，是一種性染色體異常引起的遺傳疾病，發(fā)病率為0.1%，其個體有至少2條XX性染色體，表中所列15個STS位點，其中6個為歐洲生殖學會推薦檢測位點(斜體顯示)。

表1 染色體異常核型檢出率及分布

表2 Y染色體AZF微缺失類型

至少1條Y性染色體，典型情況下為XXY，該癥于1942年首先由 Klinefelter 發(fā)現(xiàn)并描述，因出生時具備男性外生殖器，幼年時普遍被認定為男性；青春期后會逐漸具備女性性征，此病患者的癥狀表現(xiàn)常有乳房有輕微發(fā)育、睪丸發(fā)育不全或原發(fā)小睪丸癥等，并且大部分精子發(fā)生障礙而無法生育[13,14]。本研究共發(fā)現(xiàn)3例46,XX女性核型患者，8例克氏綜合征(其中1例為嵌合型)患者，均為無精子癥患者，說明性染色體的異常是精子發(fā)生障礙的最重要遺傳學原因。

3.2 染色體多態(tài)性與男性生精障礙無明顯相關性

染色體多態(tài)性又稱異態(tài)性(heteromorphism)，是指正常人群中經?？梢姷降母鞣N染色體形態(tài)的微小變異，這種變異主要表現(xiàn)為同源染色體大小形態(tài)或著色等方面的變異。染色體的多態(tài)性主要表現(xiàn)在異染色質和編碼rRNA的核仁組織者區(qū)。異染色質可分為結構異染色質和兼性異染色質。前者高度凝縮且不隨細胞周期變化，不含編碼序列，曾被認為是無活性的染色質，并主要分布于l、9和16號染色體長臂近著絲粒區(qū)和Y染色體的長臂遠端，其多態(tài)性主要表現(xiàn)為異染色質的增加或減少(以1qh+、9qh+、16qh+、Yqh+和Yqh-表示)，其次是位于近端著絲粒染色體13-15、21和22短臂上的隨體和隨體蒂(其增大增長可用13ps+和13pstk+等來表示)。隨體主要由異染色質構成，而隨體蒂則是多份重復的18S和28S rRNA基因及其編碼的核糖體蛋白所在，它們共同構成了核仁組織區(qū)。本研究中生精障礙組與對照組中染色體多態(tài)性的發(fā)生幾率無顯著差異，符合染色體多態(tài)性是染色體正常的變異這一共識[15]。值得注意的是，有研究提示Y染色體的多態(tài)性在生精障礙患者中具有較高的比率[16]，我們的研究卻未得出相似的結果。這可能與染色體多態(tài)性的判斷標準有關，因為通常都是根據(jù)顯微鏡下的觀察或核型圖像進行分析，判斷的標準卻可能因人而異或各實驗室之間不盡相同，這一問題仍需要多個實驗室大樣本的人群進一步探討。

3.3 嚴重生精障礙患者Y染色體微缺失發(fā)生率較高

Y染色體長約60 Mb，其中95%的區(qū)域除內部發(fā)生的非等位同源重組外并不與其他染色體發(fā)生片段交換，稱為男性特異性區(qū)域(male-specific region on the Y，MSY)[17]。在MSY區(qū)域中，共發(fā)現(xiàn)有156個轉錄單位，其中有78個是蛋白質編碼基因，由于其中很多基因是同一基因家族的不同拷貝，所以編碼的不同種類的功能性蛋白只有27種[18]。雖然與其他染色體相比，Y染色體的基因數(shù)目較少，但是這些已發(fā)現(xiàn)的基因被認為在性別決定和精子發(fā)生中起重要的作用。1976年，Tiepolo等發(fā)現(xiàn)所研究的無精子癥患者存在顯微鏡下可見的Yq11遠端缺失，由此推測Y染色體長臂上可能存在與精子發(fā)生相關的基因，并將其命名為無精子癥因子(azoospermia factor，AZF)[19]。1996年，Vogt等觀察到Y染色體有3個互不重疊的次級區(qū)域可以發(fā)生缺失，分別位于Y染色體長臂近端、中部、末端，并把他們區(qū)分為AZFa、AZFb和AZFc[20]。研究發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域含有眾多與精子發(fā)生相關的基因，這些區(qū)域的缺失可能會導致精子發(fā)生障礙[2,4]。AZFa位于Yq11.21，大小約800 kb。AZFa缺失會導致男性生殖細胞發(fā)育不全，即唯支持細胞綜合癥。研究發(fā)現(xiàn)Y染色體長臂上相距約800 kb，長度約10 kb的HERVI 5前病毒序列間的非等位重組導致了中間的AZFa區(qū)域缺失[21,22]。USP9Y和DDX3Y被認為是AZFa的重要候選成分[23]。AZFb位于Yq11.23，RePPing等研究發(fā)現(xiàn)，AZFb區(qū)缺失是由于回文序列P5和近端的Pl間的同源重組導致的[24]，該缺失長度達到6.2 Mb，涉及32個基因的缺失。與以往的“AZFb和AZFc是兩個獨立區(qū)域”的認識不同，該研究發(fā)現(xiàn)AZFb缺失涉及了AZFc部分區(qū)域。所以說，AZFb和AZFc有一小部分區(qū)域是重疊的。AZFb中精子生成相關的基因的主要候選為RPS4Y2、RBMY等基因[25,26]。AZFc位于MSY遠端的Yq11.23區(qū)，長度約為3.5Mb。AZFc區(qū)最為常見的男性不育基因為DAZ基因，研究發(fā)現(xiàn)，人體內DAZ基因的缺失是由于順向重復序列b2和b4間發(fā)生同源重組導致AZFc的全缺失造成的[27]。此外該區(qū)還有兩個蛋白質編碼基因家族CDY1、BPY2和至少5個非蛋白質編碼基因家族對精子的發(fā)生有影響[28,29]?；匚男蛄蠵5和遠端的P1間也可以發(fā)生重組，結果將導致AZFb全部和AZFc大部分的缺失，涉及序列長度達7.7Mb，有42個基因被去除，這就是AZFb+c的聯(lián)合缺失[30]。AZFc的全部缺失是AZF致病缺失中最常見的，是引起精子發(fā)生障礙的一個重要原因。

本研究共發(fā)現(xiàn)70例無精子癥患者存在Y染色體微缺失，總的缺失率為14.29%；22例嚴重少精子癥患者存在Y染色體微缺失，總的缺失率為11.22%，對照組未檢出Y染色體微缺失。說明Y染色體微缺失在無精子癥及嚴重少精子癥患者中的發(fā)生率較高，提示Y染色體AZF片段的缺失導致相應的基因丟失是導致精子發(fā)生障礙的重要原因。本研究人群中AZFc+d缺失(sY239- sY242- sY254- sY255- sY152)是最常見的缺失類型，占無精子癥患者的10.41%，嚴重少精子癥患者的9.18%，與國內其他研究組的統(tǒng)計結果相符合。說明AZFc區(qū)存在對精子發(fā)生影響巨大的基因，提示該區(qū)缺失是導致精子發(fā)生障礙的重要原因。

綜上所述，我們的研究證實性染色體異常和Y染色體微缺失是男性生精障礙的重要遺傳學原因，發(fā)現(xiàn)染色體多態(tài)性與精子發(fā)生障礙的相關性并不明顯。因此在男性不育癥的實驗室診斷中常規(guī)開展染色體核型分析和Y染色體微缺失基因檢測具有重要意義。另外，研究發(fā)現(xiàn)AZFc部分缺失增加了AZFc全缺失的發(fā)生風險[31]，因此進一步研究部分缺失的生殖效應機理對于探討生精障礙的遺傳學病因具有重要意義。

作者簡介：張永科(1982-)，男，碩士，醫(yī)師，研究方向：醫(yī)學遺傳學。

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