劉辰庚,郝 婷,楊婷婷,孟 雙,王培昌*

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院 檢驗科，北京100053；2.山東省菏澤市立醫(yī)院 病理科，山東 菏澤274000；3.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所 新病原室，北京102206)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一類重要的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶、語言和行為能力等發(fā)生進行性的障礙和損傷，患者逐漸喪失自主行為和生活能力，在患者蒙受痛苦的同時也給家庭和社會造成了較大負擔。但令人遺憾的是，目前針對已發(fā)病的AD患者尚無有效的治療手段，僅能通過對癥治療延緩疾病的進展；而如能對其進行早期診斷和早期干預治療則能較有效地減緩或消除AD的發(fā)病[1,2]。我課題組前期miR芯片結果表明，微小核糖核酸-29c(microRNA-29c，miR-29c)在AD模型小鼠海馬組織和外周血中顯著下調；且有研究表明其能顯著抑制AD關鍵蛋白BACE-1的表達[2,3]。本文主要就外泌體內miR-29c在AD診斷中的價值做初步判斷。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

隨機選取2015年01月-2016年12月就診于首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院的AD受試者共202例，其中輕度認知障礙期受試者(mild cognitive impairment，MCI)78例(男性40例，平均年齡62歲，女性38例，平均年齡66歲)；癡呆期受試者(dementia of the Alzheimer type，DAT)124例(男性64例，平均年齡71歲；女性60例，平均年齡75歲)。MCI和DAT的診斷符合我國神經(jīng)內科學會推薦的診斷標準[4,5]。分別針對MCI和DAT組隨機選取表面健康受試者各30例為對照組(MCI對照組：男15例，平均年齡61歲；女15例，平均年齡65歲。DAT對照組：男性17例，平均年齡72歲；女性13例，平均年齡76歲)。另隨機選取帕金森病(Parkinson’s disease，PD)患者30例(男15例，平均年齡63歲；女15例，平均年齡67歲)；血管性癡呆(vascular dementia，VD)患者30例(男15例，平均年齡58歲；女15例，平均年齡61歲)。生物參考區(qū)間建立使用隨機選取的表面健康受試者(包含以上的表面健康對照組受試者)120例，男女各半，年齡31-80歲，平均年齡55歲。本研究內容已經(jīng)宣武醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 標本采集和外泌體提取

使用含EDTA-K2的真空采血管和(BD公司)采集全部受試者的血液標本，3 000 g離心5 min分離血漿，使用Invitrogen公司的外泌體提取試劑盒提取血漿標本中的外泌體；使用天根公司(TIANGEN)miRcute miR親和柱提取和和純化外泌體內的小RNA，上述操作嚴格按說明書操作。純化好小RNA溶解于10 μl RNase-Free dd H2O(TIANGEN)中，提取出的小RNA于分析前保存于液氮中。

1.3 小RNA提取及miR-29c測定

20 μl逆轉錄體系中含RNA模板0.4 ng，20 μl miR檢測體系中含miR cDNA 1.0 μl(Qiagen)。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 25 sec，62 ℃ 35 sec，72 ℃ 25 sec，35個循環(huán)。以提取小RNA前向標本中加入的Ce_miR-39為內參，使用2-△△CT法計算并統(tǒng)計miR-29c組間表達的差異[6]。

1.4 miR提取回收試驗

分別使用表面健康受試者、帕金森患者、血管性癡呆患者、MCI和DAT患者的全血各5份，提取外泌體充分混勻后分為兩份，一份按內參工作濃度加入合成的Ce_miR-39，另一份按內參工作濃度加入等量合成的Ce_miR-39和miR-29c，分別提取小RNA并進行miR-29c和Ce_miR-39檢測。

1.5 截斷值和生物參考區(qū)間的初步建立

使用ROC曲線分別計算使用miR-29c診斷MCI和DAT的截斷值，使用表面健康受試者的95%置信區(qū)間計算miR-29c的生物參考區(qū)間，比較兩者在早期AD診斷和鑒別診斷中的價值。

1.6 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 21.0中文版統(tǒng)計軟件。非正態(tài)分布計量資料的組間比較使用Mann-Whitney U檢驗進行組間檢測結果的統(tǒng)計學分析；率的比較使用卡方檢驗(χ2檢驗)；miR提取穩(wěn)定性試驗使用配對t檢驗；截斷值確定使用受試者工作曲線(receiver operator characteristic curve,ROC曲線)；P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR提取回收實驗結果

對照組、帕金森患者、血管性癡呆患者、MCI和DAT患者血漿外泌體內Ce_miR-39的提取效率均為85%以上，且各組受試者間的提取效率無統(tǒng)計學差異(P<0.05)；對照組、帕金森患者、血管性癡呆患者、MCI和DAT患者miR-29c的回收率均在95%-105%之間，且各組受試者間的回收率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 miR提取回收實驗結果

2.2 血漿外泌體miR-29c檢測結果

MCI和DAT患者血漿外泌體內miR-29c均顯著高于對照組、帕金森患者和血管性癡呆患者(P<0.05)，且DAT患者顯著高于MCI患者(P<0.05)；對照組、帕金森患者和血管性癡呆患者血漿外泌體內miR-29c水平無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組受試者miR-29c檢測結果P值表

2.3 生物參考區(qū)間和診斷截斷值的確定

經(jīng)正態(tài)性檢驗，對照組、帕金森組、血管性癡呆組、MCI和DAT組血漿外泌體內miR-29c水平均為偏態(tài)分布，根據(jù)CLSI C28-A3標準計算出的生物參考區(qū)間為2.04-4.12。在該區(qū)間下的診斷MCI的靈敏度為65.87%，特異度為99.52%；診斷DAT的靈敏度為53.29%，特異度為100.00%使用ROC曲線確定診斷MCI和DAT的截斷值，各組間的診斷靈敏度見表3；使用截斷值診斷MCI和DAT的靈敏度高于生物參考區(qū)間法(P<0.05)，特異度無顯著性差異(P>0.05)。

表3 以截斷值分析各組的診斷效能

3 討論

AD作為重要的神經(jīng)變性病，近年來在我國老年人群中的發(fā)病率呈升高趨勢。該病的特點之一是起病早，在發(fā)病的10年至20年前神經(jīng)元細胞就已開始出現(xiàn)相關的病理生理改變；同時，對于進入DAT期的患者而言目前尚無有效的臨床治療手段，僅能采取對癥治療以提高生命質量；而對于MCI患者而言，則可通過藥物和物理療法延緩或阻止其進入DAT期[7-10]。故對MCI甚至MCI前期的患者做出有效的診斷和預警對于AD的治療防控至關重要，而目前被公認的AD早期診斷生物標志物主要為腦脊液的tau蛋白、Aβ42和PET成像等；對于腦脊液生物標志物而言，其為有創(chuàng)檢查，較難以被患者接受，對于后者而言其檢測費用較昂貴，不適用于篩查性檢測?；诖?，美國阿爾茨海默病協(xié)會的多名專家聯(lián)合撰文建議尋找給予血液或尿液的非有創(chuàng)檢查的AD早期診斷生物標志物[11]。

本室的前期研究表明，3月齡APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠海馬組織中的miR-29c即呈顯著下降趨勢，且其腦脊液和外周血外泌體中的miR-29c亦顯著性降低，提示其可作為AD早期診斷的生物標志物[2]。同時，有研究表明其能顯著抑制AD關鍵蛋白BACE-1的表達，其降低可能導致BACE-1的異常高表達，推進AD的進展。作為能跨膜轉運核算和蛋白質的囊泡性結構，外泌體在疾病診斷和和治療中的價值已被越來越深入地闡述[12]。本研究選取了較大標本量的MCI和DAT其受試者分別進行了血漿外泌體內miR-29c的檢測，研究結果表明，MCI和和DAT患者血漿外泌體內miR-29c均顯著低于表面健康受試者，初步證實了其在AD診斷特別是早期診斷中的價值。對于miR而言，其在提取過程中的穩(wěn)定性和損失率至關重要，由于不同疾病受試者其血漿內和外泌體內載體蛋白的種類和水平可能各不相同，故其對相應miR運輸和保護作用亦可能有差異，可能會對檢測結果和統(tǒng)計學分析結果造成干擾[12,13]。miR穩(wěn)定性試驗表明，使用本方法提取miR-29c在相似疾病人群和健康人群中的回收率均較為一致，提示利用本方法提取和檢測miR-29c可有效反應患者體內的實際情況。

生物標志物可存在多個醫(yī)學決定水平，一般可包括參考范圍上限和下限以及針對不同疾病的截斷值。本研究的結果提示，對于在MCI和DAT的診斷和鑒別診斷而言，外泌體內miR-29c的截斷值高于生物參考區(qū)間的上限，這使應用其對MCI和DAT進行診斷有了更好的區(qū)分度。同時，對于具有相似臨床表現(xiàn)和發(fā)病機制疾病的鑒別診斷其也有較高的效能，但對其與AD其他診斷標志物的相關性尚待研究。

綜上，本研究結果提示，外泌體內miR-29c可作為AD診斷，特別是早期診斷的候選生物標志物，且應使用其截斷值而不是生物參考區(qū)間對AD進行早期診斷，這為AD非有創(chuàng)檢查生物標志物的尋找和鑒定提供了一個潛在方向。

作者簡介：劉辰庚(1980-)，男，博士，副主任技師，副教授，碩士生導師，主要科研方向：衰老和相關疾病標志物篩選。王培昌(1965-)，男，主任技師，教授，博士生導師，主要科研方向：衰老和相關疾病機制研究及標志物篩選。

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