戎瑞雪，王中傲，李曉嬋，韓躍華，張 奇，李志鵬，郭云然，曹志然*，王 蓓*

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的主要疾病之一，為全球人類死亡的第二大原因[1-2]。據(jù)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)最新公布的數(shù)據(jù)，我國(guó)每年新發(fā)癌癥病例約310萬(wàn)，死亡約200萬(wàn)。近20 年來(lái)，我國(guó)癌癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，隨著老齡化進(jìn)程的加快，我國(guó)癌癥發(fā)病、死亡率還將不斷上升，對(duì)國(guó)家、社會(huì)和個(gè)人造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3-5]。目前藥物治療是腫瘤綜合治療的重要治療手段之一。從天然動(dòng)、植物中提取的天然活性物質(zhì)是抗癌藥物的重要來(lái)源之一[6-7]，其中倍半萜類化合物具有抗腫瘤活性，廣泛分布于高等真菌、植物、昆蟲(chóng)和海洋生物體內(nèi)[8-10]。絨白乳菇（Lactarius vellereus）屬紅菇科（Russulaceae）乳菇屬（Lactarius）[11-12]。絨白乳菇雖有毒，但經(jīng)過(guò)浸泡、煮沸后即可食用，具有食藥同源的功效。本課題組從絨白乳菇中分離純化出多種新的蛇麻烷Humulane倍半萜（正在申請(qǐng)專利），前期的初篩實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中的一種新型倍半萜（命名為乳菇菌素D）具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，進(jìn)一步研究乳菇菌素D對(duì)多種不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞的抑制作用；并選取敏感腫瘤細(xì)胞株初步研究其抗腫瘤作用機(jī)制，為絨白乳菇的食藥同源應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A549（人肺腺癌細(xì)胞株）、HCT-8（人結(jié)腸癌細(xì)胞株）、Bel-7402（人肝癌細(xì)胞株）、SMMC7721（人肝癌細(xì)胞株）、HeLa（人宮頸癌細(xì)胞株）均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心；在-196 ℃液氮中凍存，由本實(shí)驗(yàn)室體外傳代培養(yǎng)。

乳菇菌素D為本課題組從絨白乳菇中提取，純度為98.8%，用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）溶解為10 mg/mL的儲(chǔ)存液，-20 ℃保存?zhèn)溆?；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)GIBCO公司；胰蛋白酶（1∶250）北京Solarbio公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT） 美國(guó)Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M4多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices有限公司；8000二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測(cè)乳菇菌素D對(duì)幾種人腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

常規(guī)復(fù)蘇HeLa、A549、SMMC7721、Bel-7402和HCT-8細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL，90 μL/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后換為含乳菇菌素D終質(zhì)量濃度分別為100、10、1、0.1、0.01 μg/L的完全培養(yǎng)液；同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照為與乳菇菌素D終質(zhì)量濃度相同的順鉑；陰性對(duì)照為分別含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.000 1% DMSO的培養(yǎng)液（與待測(cè)樣品中含的DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同），各質(zhì)量濃度組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)20、44、68 h后，加MTT（5 mg/mL）15 μL/孔，4 h后棄上清液，加DMSO 150 μL/孔，振蕩5 min，經(jīng)多功能酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，并通過(guò)軟件計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.2 乳菇菌素D作用A549細(xì)胞后倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察

調(diào)整A549細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，以2 mL/皿接種于玻底小皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜，換為終質(zhì)量濃度為10 μg/mL乳菇菌素D的DMEM培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組加入等體積含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% DMSO的完全培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.3.3 乳菇菌素D作用A549細(xì)胞后瑞-姬氏染色光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察

將1×105個(gè)/mL的A549細(xì)胞接種于預(yù)置蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板中，2 mL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜，換為終質(zhì)量濃度為10 μg/mL乳菇菌素D，并設(shè)陰性對(duì)照組（同1.3.2節(jié)）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出蓋玻片，磷酸鹽緩沖液沖洗后，進(jìn)行瑞-姬氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳菇菌素D處理的A549細(xì)胞凋亡率及周期分布

A549細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于6 孔板，2 mL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜，換終質(zhì)量濃度分別為100、10、l μg/mL的含乳菇菌素D的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，并設(shè)陰性對(duì)照（同1.3.2節(jié)）。收集孔內(nèi)所有細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗2 次。分別取細(xì)胞1×106個(gè)，每份樣本加入5 μL AnnexinⅤ染液和10 μL碘化丙啶染液，室溫避光染色20 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

用上述相同方法處理收集細(xì)胞，分別取1×106個(gè)細(xì)胞，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液1 mL（4 ℃預(yù)冷）固定，4 ℃過(guò)夜；1 000 r/min離心5 min除去固定液，磷酸鹽緩沖液洗滌2 次后，100 μg/mL RNA酶100 μL 37 ℃消化30 min；加入50 μg/mL碘化丙啶染色液100 μL，4 ℃避光染色30 min；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均在計(jì)算機(jī)SPSS 16.0軟件包內(nèi)進(jìn)行，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳菇菌素D對(duì)不同組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞的抑制作用

圖1 乳菇菌素D對(duì)腫瘤細(xì)胞作用24、48、72 h的IC50Fig. 1 IC50 of mitissimol D against cancer cells at 24, 48 and 72 h

由圖1可知，乳菇菌素D對(duì)A549、Bel-7402、SMMC7721和HeLa細(xì)胞的體外增殖有顯著的抑制作用，其作用72 h的IC50分別為2.46、19.09、18.21、17.05 μg/mL，均小于20 μg/mL，而對(duì)HCT-8抑制作用較弱（IC50為137.26 μg/mL）。

2.2 倒置顯微鏡觀察乳菇菌素D對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2 乳菇菌素D作用24 h和48 h后A549細(xì)胞形態(tài)變化（×1 000）Fig. 2 Morphological observation of A549 cells treated with mitissimol D for 24 and 48 h (× 1 000)

由圖2可知，乳菇菌素D作用后24 h，A549細(xì)胞連接開(kāi)始消失、細(xì)胞變圓、脫落，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞脫落逐漸明顯，至作用后48 h全部脫落，且細(xì)胞皺縮，體積變小，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒。

2.3 瑞-姬氏染色光學(xué)顯微鏡下觀察乳菇菌素D對(duì)A549細(xì)胞作用后形態(tài)學(xué)變化

圖3 瑞-姬氏染色光學(xué)顯微鏡下乳菇菌素D作用48 h后A549細(xì)胞形態(tài)變化（×400）Fig. 3 Morphological changes of A549 cells by Wrights-Giemsa staining after being treated with mitissimol D for 48 h (× 400)

由圖3可知，陰性對(duì)照組細(xì)胞，染成深藍(lán)色或藍(lán)紫色（圖中未顯示），色澤均一，胞膜完整；10 μg/mL乳菇菌素D組細(xì)胞，胞膜皺縮，染色質(zhì)在核周聚集，細(xì)胞核固縮碎裂成數(shù)個(gè)圓形顆粒即界限分明的凋亡小體。

2.4 乳菇菌素D對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度的乳菇菌素D作用于A549細(xì)胞72 h的凋亡率Fig. 4 Apoptosis rates of A549 cells treated with mitissimol D at different concentrations for 72 h

圖5 乳菇菌素D作用于A549細(xì)胞72 h的凋亡率Fig. 5 Apoptosis rates of A549 treated with mitissimol D at 72 h

如圖4、5所示，1、10、100 μg/mL乳菇菌素D作用于A549細(xì)胞72 h后，細(xì)胞凋亡率分別為（10.43±2.32）%、（20.22±1.96）%、（32.14±3.04）%，與陰性對(duì)照組的（4.98±0.59）%比較，凋亡率升高（P＜0.01）。

2.5 乳菇菌素D對(duì)A549細(xì)胞周期分布的影響

表1 乳菇菌素D作用72 h對(duì)A549細(xì)胞周期的影響Table 1 Effect of mitissimol D on cell cycle of A549 cells at 72 h%

圖6 乳菇菌素D對(duì)A549細(xì)胞周期的影響Fig. 6 Effect of mitissimol D on cell cycle of A549 cells

由表1、圖6可知，與陰性對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度的乳菇菌素D（100、10、1 μg/mL）作用于A549細(xì)胞72 h，S期細(xì)胞比例明顯增多，G1期細(xì)胞比例明顯減少，并且隨乳菇菌素D劑量的增加，乳菇菌素D對(duì)A549細(xì)胞周期的影響增強(qiáng)。其中10、100 μg/mL劑量組變化明顯，與陰性對(duì)照組相比，G1期、S期細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果表明乳菇菌素D使A549細(xì)胞主要阻滯于S期。

3 討 論

高等真菌又稱為大型真菌，包括蘑菇、香菇、銀耳、金針菇、竹蓀、牛肝菌、靈芝等，許多高等真菌素有“三高”美稱，即蛋白質(zhì)含量高、維生素含量高、纖維素含量高[13]。真菌還有很高的藥用價(jià)值，由于其中含有較多的真菌多糖和小分子的萜類物質(zhì)，具有提高免疫力、抑制癌細(xì)胞增殖等生物活性[14-15]。真菌多糖的藥物活性被很多學(xué)者關(guān)注研究[16-18]，其中香菇多糖腹腔灌注治療晚期肝癌腹水，效果顯著[19]，此外香菇多糖對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化活性有顯著提高作用[20]。繼真菌多糖后，萜類化合物也是重要的抗腫瘤活性成分之一[21-25]。高等真菌中提取物倍半萜的抗腫瘤作用機(jī)制，國(guó)內(nèi)外學(xué)者有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，目前其抗腫瘤作用機(jī)制的闡述主要有：作用于線粒體導(dǎo)致其功能紊亂、抑制腫瘤細(xì)胞血管生成能力、干擾細(xì)胞循環(huán)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致癌細(xì)胞程序化凋亡、直接作用于腫瘤細(xì)胞、擾亂細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞程序化死亡、通過(guò)對(duì)關(guān)鍵酶的磷酸化造成DNA損傷影響細(xì)胞增殖等[1,26]。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，從絨白乳菇菌中提取的倍半萜類化合物-乳菇菌素D對(duì)不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用，其中對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549抑制作用最強(qiáng)，而對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8細(xì)胞毒性作用較弱，表明其抗腫瘤作用具有一定的組織選擇性，因此選擇A549作為敏感瘤株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，研究其抗腫瘤作用機(jī)制。

首先，從形態(tài)學(xué)上，參照侯毅鞠等[27]對(duì)鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的倍半萜烯類化合物T-2毒素對(duì)體外培養(yǎng)急性早幼粒白血病細(xì)胞HL60生長(zhǎng)抑制作用的研究，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用瑞-姬氏染色法觀察到了乳菇菌素D對(duì)A549細(xì)胞作用48 h后的凋亡小體。

隨后，從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面著手，根據(jù)Zheng Yongbiao等[28]對(duì)從中國(guó)食用菌鮑魚(yú)菇中提取的新倍半萜類化合物抑制人前列腺癌細(xì)胞的研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了乳菇菌素D作用于A549細(xì)胞72 h后的凋亡率為32.14%。乳菇菌素D對(duì)A549細(xì)胞的IC50為2.46 μg/mL，用100 μg/mL的乳菇菌素D處理后凋亡率只有32.14%，說(shuō)明該化合物的除了誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡外，可能存在其他抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。

再次，本實(shí)驗(yàn)追蹤藥物引起細(xì)胞凋亡的原因。王佳麗等[29]從莪術(shù)油中提取倍半萜類化合物作用于肝癌細(xì)胞HepG2，使得細(xì)胞周期阻滯在G0/G1-S期和S-G2/M期；Imamura等[30]從日本北部的可食用野生植物delphiniifolia中分離提取的沒(méi)藥烷型倍半萜過(guò)氧化合物，引起G1和G2期細(xì)胞阻滯。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，乳菇菌素D對(duì)A549細(xì)胞作用72 h后，多數(shù)細(xì)胞阻滯于S期，并且有劑量依賴性。由此可見(jiàn)，乳菇菌素D可通過(guò)擾亂細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)絨白乳菇菌中提取的乳菇菌素D的抗腫瘤作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了此類倍半萜化合物抗腫瘤活性具有選擇性，對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖的抑制作用顯著，可通過(guò)干擾細(xì)胞增殖周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。乳菇菌素D作用機(jī)制的研究對(duì)以乳菇菌素為主要成分的新型抗腫瘤藥物及相關(guān)制劑的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

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