閆博陽 趙津璋 陳 虹

(黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院,佳木斯 154002)

動(dòng)脈粥樣硬化是一種常見的心血管系統(tǒng)疾病，也是多種心腦血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelial cell，VEC)和平滑肌細(xì)胞受損是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要原因，其受損后可以引發(fā)血管內(nèi)膜增生、斑塊沉積等現(xiàn)象[1,2]。研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與細(xì)胞凋亡有關(guān)，而VEC凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化過程中發(fā)揮重要作用，VEC大量凋亡會(huì)引起單層內(nèi)皮通透性增加，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞進(jìn)入到內(nèi)膜，損害血管，形成斑塊[3,4]。

第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromo-some 10，PTEN)具有雙特異性的磷酸酶活性，能夠調(diào)控細(xì)胞的生長、凋亡等過程，并且在癌癥發(fā)生、心肌缺血再灌注、心肌肥厚等疾病發(fā)生過程中也具有調(diào)控作用，對于血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為、心臟發(fā)育、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等具有重要意義[5,6]。研究顯示，ox-LDL刺激后的VEC中PTEN表達(dá)下調(diào)，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[7]。為了明確PTEN在動(dòng)脈粥樣硬化組織中的表達(dá)，探討PTEN在VEC增殖凋亡中的作用，本研究構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，并通過體外分離培養(yǎng)大鼠VEC，以期為研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 20只ApoE-/-小鼠，雄性，6～8周齡，體重18～20 g，購自南京君科生物工程有限公司；SD雄性大鼠8只，6周齡，體重160～180 g購自佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室；PTEN和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPD-H)引物均由南京金斯瑞合成；Real time-PCR試劑盒、cDNA合成試劑盒購自大連TaKaRa；RNA提取試劑盒購自北京TIANGEN；蛋白提取試劑盒購自上海 BestBio；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白提取試劑盒購自美國Biomiga ；氧化低密度脂蛋白(Cu-oxidized LDL，ox-LDL)購自北京索萊寶；鼠尾膠原購自美國Sigma；磷酸化的STAT3(p-STAT3)一抗、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)一抗、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)一抗、PTEN一抗均購自美國Abcam；GAPDH一抗購自美國Santa Cruz；Lpofectamine 2000購自美國Invitrogen。

1.2方法

1.2.1動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型構(gòu)建 ApoE-/-小鼠20只隨機(jī)分為兩組，每組10只，分別為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠用高脂飼料(含有1%膽固醇和15%豬油)飼喂。對照組用正常的飼料飼喂。兩組小鼠均不限制飲水，飼養(yǎng)時(shí)間為12周。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3.5 ml/kg)，取實(shí)驗(yàn)組小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化組織和對照組的正常動(dòng)脈組織檢測PTEN水平。

1.2.2Real time-PCR檢測組織中PTEN水平 取動(dòng)脈粥樣硬化組織和對照組的正常動(dòng)脈組織，提取RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA樣品的濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real time-PCR檢測PTEN水平，內(nèi)參為GAPDH，以2-ΔΔCt方法計(jì)算PTEN表達(dá)。PTEN上游引物為5′-TCAGACTTTTGTAATTTGTGTATG-3′，下游引物5′-ACAGGCTCCCAGACA-TGACA-3′。GAPDH上游引物為5′-CAGCGACACCCACTCCTC-3′，下游引物5′-TGAGGATCCACCA-CCCTGT-3′。程序?yàn)椋?5℃ 15 min；94℃ 15 s；58℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.3Western blot檢測組織中PTEN水平 取動(dòng)脈粥樣硬化組織和對照組的正常動(dòng)脈組織，提取組織蛋白，BCA法定量，蛋白與5×Loading buffer以4∶1混合煮沸5 min。每孔中加入40 μg進(jìn)行電泳，SDS-PAGE凝膠用5%濃縮膠和10%分離膠，蛋白還未到達(dá)分離膠前用80V電壓，到達(dá)分離膠后用100V電壓。轉(zhuǎn)膜：4℃，250 mA，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min。封閉：放在5%牛血清白蛋白中，37℃孵育60 min。一抗孵育：600倍稀釋，4℃過夜。二抗孵育：1∶600倍稀釋，1∶2 000倍稀釋，37℃，90 min。顯色以GAPDH為內(nèi)參，Quantity one分析蛋白水平。

1.2.4VEC分離培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[8]，取SD雄性大鼠血管組織，放在DMEM中，在無菌條件下用鑷子把血管外的結(jié)蹄組織和脂肪組織剝離以后，磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，把血管外翻使血管內(nèi)膜暴露在外，用滅菌線把血管的兩頭折入以后結(jié)扎，用DMEM反復(fù)洗滌內(nèi)膜，把血管放在0.2%的膠原酶中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。用含有20%的DMEM洗滌2次，將血管剪成2 mm2左右的組織塊，內(nèi)膜向下種植到用鼠尾膠原包被過的培養(yǎng)瓶中，加入20%的DMEM，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，再加入1 ml的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。觀察細(xì)胞長滿細(xì)胞瓶壁以后，加入0.25%的胰蛋白酶消化1 min，1 000×g離心10 min，用20%胎牛血清的DMEM懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。本次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為第3代細(xì)胞。

1.2.5MTT檢測ox-LDL對細(xì)胞增殖活性的影響 取上述VEC，以每毫升含有105個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別用含有ox-LDL濃度為0、6、12、24、48 μg/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，每個(gè)濃度梯度設(shè)置5復(fù)孔。每孔中加入200 μl的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，加入5 mg/ml的MTT溶液孵育4 h。將上清液吸除后，加入二甲基亞砜溶液150 μl，混合后，酶標(biāo)儀490 nm檢測吸光度(Absorbance，A值)。計(jì)算細(xì)胞存活率。以0 μg/ml ox-LDL作用組為對照，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(ox-LDL作用組A值÷對照組A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.6細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 VEC分為對照組、ox-LDL組、PTEN組，對照組和ox-LDL組細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照載體(pSicoR)。PTEN組細(xì)胞轉(zhuǎn)染PTEN過表達(dá)載體(pSicoR-PTEN)，步驟參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染后ox-LDL組、PTEN組分別用含有24 μg/ml的ox-LDL的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，對照組細(xì)胞用不含ox-LDL的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h ，用Real time-PCR和Western blot法檢測PTEN表達(dá)水平，步驟參照1.2.2和1.2.3，同時(shí)用MTT法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h的存活率，步驟同1.2.5。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 對照組、ox-LDL組、PTEN組細(xì)胞分別按照1.2.6中處理后，培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS將細(xì)胞調(diào)整為每毫升含有106個(gè)細(xì)胞，取1 ml的細(xì)胞懸浮液，離心，收集細(xì)胞沉淀，加入200 μl的結(jié)合緩沖液，加入5 μl的碘化丙啶(Propidium iodide，PI)和膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)，室溫孵育15 min，加入300 μl的結(jié)合緩沖液，在60 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。對照組、ox-LDL組、PTEN組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，Western blot法檢測 p-STAT3、STAT3、Cleaved Caspase-3水平，步驟參照1.2.3。

2 結(jié)果

2.1PTEN在動(dòng)脈粥樣硬化組織中的表達(dá) 結(jié)果如圖1和表1所示，正常組織和動(dòng)脈粥樣硬化組織中PTEN mRNA水平依次為：1.00±0.12、0.47±0.10。PTEN蛋白水平依次為：0.45±0.06、0.18±0.02。動(dòng)脈粥樣硬化組織中PTEN mRNA和蛋白水平均明顯低于正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。動(dòng)脈粥樣硬化組織中PTEN水平下調(diào)。

2.2ox-LDL對VEC增殖影響 結(jié)果如表2所示，0、6、12、24、48 μg/ml的ox-LDL刺激后的VEC存活率依次為：(100.00±11.52)%、(83.24±6.14)%、(70.41±3.69)%、(51.58±3.75)%、(35.69±2.87)%。6、12、24、48 μg/ml的ox-LDL刺激后的VEC存活率明顯低于0 μg/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VEC的存活率隨著ox-LDL作用濃度的升高而降低。24 μg/ml的ox-LDL刺激后的VEC存活率接近50%，后續(xù)選用24 μg/ml的ox-LDL作用于VEC。

2.3各組細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平 結(jié)果如圖2和表3所示，對照組、ox-LDL組、PTEN組PTEN mRNA依次為：1.00±0.08、0.42±0.03、0.69±0.05，PTEN 蛋白依次為：0.53±0.06、0.17±0.03、0.34±0.02。ox-LDL組細(xì)胞中PTEN mRNA和蛋白水平均明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 Western blot檢測PTEN在動(dòng)脈粥樣硬化組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of PTEN in atherosclerosis tissues detected by Western blotNote:1.Normal tissue;2.Atherosclerotic tissue.

TissuemRNAProteinNormaltissue100±012045±006Atherosclerotictissue047±0101)018±0021)

Note：Compared with normal tissues,t1=5.212,t2=7.394,1)P<0.05.

ox?LDLconcentration(μg/ml)Cellsurvivalrate(%)010000±115268324±6141)127041±3691)2)24 5158±3751)2)3)48 3569±2871)2)3)4)F46809P0000

Note：Compared with 0 μg/ml,t1=3.195，t2=5.642，t3=9.232，t4=12.261，1)P<0.05;compared with 6 μg/m，t1=2.446，t2=6.036，t3=9.066，2)P<0.05;compared with 12 μg/ml，t1=3.590，t2=6.620，3)P<0.05;compared with 24 μg/ml，t=3.030，4)P<0.05.

PTEN組細(xì)胞中PTEN mRNA和蛋白水平均明顯高于ox-LDL組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ox-LDL能夠降低VEC中PTEN的表達(dá)，轉(zhuǎn)染PTEN過表達(dá)載體能夠提高VEC中PTEN的水平。

2.4各組細(xì)胞增殖凋亡檢測結(jié)果 如圖3和表4所示，對照組、ox-LDL組、PTEN組細(xì)胞存活率依次為：(100.00±9.36)%、(49.28±6.71)%、(74.62±5.73)%，細(xì)胞凋亡率依次為：(5.85±0.06)%、(44.25±3.28)%、(23.42±2.54)%。ox-LDL組細(xì)胞存活率明顯低于對照組，而凋亡率明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PTEN組細(xì)胞存活率明顯高于ox-LDL組，而凋亡率明顯低于ox-LDL組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ox-LDL促進(jìn)VEC凋亡，抑制VEC增殖，而PTEN能夠減緩ox-LDL對VEC增殖凋亡的作用。

圖2 Western blot檢測ox-LDL刺激后細(xì)胞中PTEN表達(dá)Fig.2 PTEN expression detected by Western blot in cells after ox-LDL stimulation

GroupsmRNAProteinControlgroup100±008053±006ox?LDLgroup042±0031)017±0031)PTENgroup069±0052)034±0022)F7735729571P00000000

Note：Compared with the control group,t1=12.429，t2=10.910，1)P<0.05;compared with ox-LDL group,t1=6.643，t2=5.758，2)P<0.05.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況Fig.3 Cell apoptosis detected by flow cytometry

2.5p-STAT3、STAT3、Cleaved Caspase-3水平檢測結(jié)果 如圖4和表5所示，對照組、ox-LDL組、PTEN組細(xì)胞p-STAT3水平依次為：0.85±0.08、0.32±0.03、0.58±0.04，細(xì)胞STAT3水平依次為：2.11±0.25、2.13±0.21、2.12±0.20，細(xì)胞Cleaved Caspase-3水平依次為：0.28±0.04、2.05±0.16、0.82±0.06。ox-LDL組細(xì)胞p-STAT3水平明顯低于對照組，而Cleaved Caspase-3水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PTEN組細(xì)胞p-STAT3水平明顯高于ox-LDL組，而Cleaved Caspase-3水平明顯低于ox-LDL組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

GroupsSurvivalrate(%)Apoptosisrate(%)Controlgroup10000±936585±006ox?LDLgroup4928±6711)4425±3281)PTENgroup7462±5732)2342±2542)F34981193204P00010000

Note：Compared with the control group,t1=8.364，t2=19.634，1)P<0.05;compared with ox-LDL group,t1=4.186，t2=8.983，2)P<0.05.

圖4 Western blot檢測p-STAT3、STAT3、Cleaved Caspase-3水平Fig.4 p-STAT3,STAT3,Cleaved Caspase-3 levels detected by Western blot

Groupsp?STAT3STAT3CleavedCaspase?3Controlgroup085±008211±025028±004ox?LDLgroup032±0031)213±021205±0161)PTENgroup058±0042)212±020082±0062)F 710230006181724P 000009940000

Note：Compared with the control group,t1=11.918，t2=17.768，1)P<0.05;compared with ox-LDL group,t1=6.071,t2=2.901,2)P<0.05.

3 討論

人的PTEN基因可以編碼403個(gè)氨基酸，其含有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，C2區(qū)域和磷酸酶區(qū)域，磷酸酶結(jié)構(gòu)域調(diào)控酶催化過程，而C2區(qū)在PTEN與膜脂的結(jié)合中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在PTEN的C端含有能夠與PDZ結(jié)合的區(qū)域，是PTEN與相關(guān)支架蛋白結(jié)合的重要區(qū)域，其還具有自身的去磷酸功能，這些PTEN的結(jié)構(gòu)域和自身特點(diǎn)是其調(diào)控細(xì)胞生長、凋亡等過程的重要基礎(chǔ)[9-12]。研究顯示，PTEN在心肌肥大、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病中具有調(diào)控功能。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與細(xì)胞免疫炎癥、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等相關(guān)[13,14]。PTEN具有抗炎作用，能夠通過調(diào)控中性粒細(xì)胞的趨化減弱組織炎癥，并且能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[15,16]。本研究結(jié)果顯示，動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中PTEN表達(dá)水平下降，PTEN可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生不僅與平滑肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞等有關(guān)，其中VEC也參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[17]。研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化與細(xì)胞的大量凋亡有關(guān)，VEC大量凋亡可以引起VEC數(shù)量急劇減少，引起單層內(nèi)皮通透性發(fā)生改變，平滑肌細(xì)胞和單核細(xì)胞遷移到內(nèi)膜后，造成內(nèi)膜損傷，VEC凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的早期事件[18-21]。本研究通過體外分離培養(yǎng)大鼠VEC，用ox-LDL處理后發(fā)現(xiàn)PTEN的表達(dá)水平也明顯下調(diào)，與動(dòng)脈粥樣硬化組織中檢測結(jié)果相符合，PTEN在動(dòng)脈粥樣硬化中表達(dá)下調(diào)。本研究通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法提高VEC中PTEN的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PTEN后的VEC經(jīng)過ox-LDL處理后的細(xì)胞增殖活性有所升高，細(xì)胞凋亡率有所降低，PTEN抑制ox-LDL對VEC的損傷。

細(xì)胞的生長和凋亡與細(xì)胞內(nèi)信號通路的傳導(dǎo)有關(guān)，是受到多種基因嚴(yán)格調(diào)控的過程[22]。STAT3是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤關(guān)系最為密切的STAT蛋白家族成員之一，在相關(guān)細(xì)胞因子的作用下，STAT3磷酸化水平升高，導(dǎo)致STAT3被激活，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長[23-25]。Caspase蛋白家族參與細(xì)胞凋亡過程，Caspase-3、Caspase-7、Caspase-6等是凋亡執(zhí)行子，可以通過與底物特應(yīng)性結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而Caspase-3活化后是細(xì)胞凋亡不可逆的標(biāo)志，也是Caspase家族中最為重要的成員之一[26-28]。研究顯示，STAT3能夠促進(jìn)VEC增殖，抑制VEC凋亡[29,30]。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL能夠抑制VEC中STAT3的磷酸化，而PTEN可提高STAT3磷酸化水平，PTEN可能通過促進(jìn)STAT3信號通路影響VEC增殖和凋亡。

綜上所述，PTEN在動(dòng)脈粥樣硬化組織中表達(dá)下調(diào)，ox-LDL促進(jìn)VEC凋亡，抑制VEC增殖，而過表達(dá)PTEN可以抑制VEC凋亡，促進(jìn)VEC增殖，作用機(jī)制可能與STAT3信號通路的激活有關(guān)。本研究結(jié)果為探討PTEN在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用奠定了基礎(chǔ)，對研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制具有重要意義。本研究存在一定的局限性，PTEN在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用機(jī)制是否與STAT3有關(guān)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，并且在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)繼續(xù)探討PTEN對其他相關(guān)信號通路的作用。

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