龐高舉 孫麗妲 姚 楠 查曉宇 梁聚友 檀 露 張 虹 喬 賽 白 虹

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，國(guó)家教育部免疫微環(huán)境與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市細(xì)胞和分子免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300070)

衣原體是嚴(yán)格胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌，沙眼衣原體可引起沙眼和包涵體結(jié)膜炎，并能通過(guò)泌尿道感染引起性傳播疾病，導(dǎo)致女性盆腔炎、輸卵管炎以及不孕不育，并且可以通過(guò)呼吸道感染引起衣原體肺炎。沙眼衣原體小鼠肺炎株(Chlamydia muridarum,Cm)呼吸道感染動(dòng)物模型常被用來(lái)研究沙眼衣原體致病機(jī)制[1]。不同遺傳背景的小鼠對(duì)衣原體感染的易感性不同，C57BL/6(C57)小鼠為衣原體感染抵抗表型，而C3H/HeN為易感表型[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Cm呼吸道感染C3H小鼠，感染肺組織有大量持續(xù)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并伴隨前炎癥細(xì)胞因子及中性粒細(xì)胞趨化因子的高表達(dá)，導(dǎo)致組織過(guò)度的炎癥反應(yīng)，與C57小鼠比較有較高的死亡率[3]。

Toll樣受體作為主要的模式識(shí)別受體可以與病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)結(jié)合激活固有免疫應(yīng)答，并且可以橋連適應(yīng)性免疫[4]。TLR4主要識(shí)別細(xì)菌LPS，TLR2可識(shí)別革蘭陽(yáng)性菌肽聚糖、脂蛋白等多種細(xì)菌產(chǎn)物[5]，二者均可以激活MyD88依賴的信號(hào)通路誘發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體感染后患者體內(nèi)TLR2、TLR4和TLR9的表達(dá)水平與患者易感性以及感染進(jìn)程有關(guān)[7]。另有研究已證實(shí)沙眼衣原體感染生殖道后，TLR2、TLR4和MyD88的表達(dá)均升高，使用抗體封閉后，相應(yīng)的前炎癥因子表達(dá)減少，減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)[1,5]。本研究擬討論小鼠沙眼衣原體呼吸道感染TLR2、TLR4及MyD88的表達(dá)與疾病易感性的關(guān)系，以闡明C3H小鼠衣原體呼吸道感染過(guò)度炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 6～8周齡雌性C57BL/6(C57)和C3H/HeN (H-2k)(C3H)小鼠(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。所用墊料、鼠糧、飲用水均為清潔無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)，所有飼養(yǎng)程序嚴(yán)格按照天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心操作規(guī)程進(jìn)行。沙眼衣原體小鼠肺炎菌株(由加拿大曼尼托巴大學(xué)楊熙教授饋贈(zèng))1×103IFU經(jīng)小鼠呼吸道感染，建立小鼠衣原體呼吸道感染模型。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1肺組織總RNA提取 使用Trizol(Invitro-gen)試劑，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作提取肺組織總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度。

1.2.2RT-PCR 按照說(shuō)明書(shū)取一定量的RNA用于反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入模板進(jìn)行PCR。相關(guān)引物序列如下：β-actin(550 bp)正義鏈：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′；反義鏈：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′；TLR2(295 bp)正義鏈：TTTGCTCCTGCGAACTCCTA；反義鏈：GCTTTCTTGGGCTTCCTCTT；TLR4(349 bp)正義鏈：GGGTCAAGGAACAGAAGCA；反義鏈：TGAAGGCAGAGGTGAAAGC；MyD88(488 bp)正義鏈：ATCCGGGTCCCTGGACTCCTTCAT；反義鏈：TGGTGATGCCTCCCAGTTCCTT。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，用WCIF ImageJ分析電泳條帶(OD)值，用GraphPad做統(tǒng)計(jì)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Paswstat軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Student′st檢測(cè)進(jìn)行組間組內(nèi)比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Cm呼吸道感染誘導(dǎo)TLR2、TLR4在C3H小鼠肺組織高表達(dá) TLR2和TLR4是衣原體抗原與宿主細(xì)胞結(jié)合的主要細(xì)胞膜受體，在衣原體誘導(dǎo)的宿主固有性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，因此我們探討對(duì)衣原體高易感和抵抗小鼠肺組織TLR2和TLR4 mRNA的表達(dá)是否存在差異。結(jié)果顯示(圖1)，Cm呼吸道感染后第7天和第14天，C3H小鼠肺組織TLR2和TLR4 mRNA的表達(dá)均顯著高于C57小鼠(P<0.001或P<0.05)，尤其在感染第14天TLR2和TLR4 mRNA的表達(dá)仍維持在較高水平，表明在沙眼衣原體呼吸道感染中，TLR2、TLR4受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)與C3H小鼠過(guò)度炎癥應(yīng)答密切相關(guān)。

2.2Cm呼吸道感染誘導(dǎo)MyD88在C3H小鼠肺組織過(guò)度表達(dá) 衣原體抗原結(jié)合TLR2和TLR4后主要通過(guò)激活MyD88依賴的信號(hào)通路誘發(fā)炎癥反應(yīng)。結(jié)果(圖2)顯示，Cm呼吸道感染C3H小鼠肺組織MyD88 mRNA的表達(dá)顯著高于C57小鼠，尤其在感染的第14天，C57 MyD88 mRNA的表達(dá)恢復(fù)到基線水平而C3H小鼠仍維持高表達(dá)(P<0.01)，并與TLR2和TLR4表達(dá)趨勢(shì)一致。結(jié)果提示，在Cm呼吸道感染中，Cm結(jié)合TLR2和TLR4，激活下游MyD88途徑，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，這些因子在C3H小鼠的過(guò)度表達(dá)與其高易感性密切相關(guān)。

圖1 感染后不同時(shí)間點(diǎn)C3H和C57小鼠肺組織TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)Fig.1 Expression of TLR2 and TLR4 mRNA in lung from C3H and C57 mice postinfectionNote:A.mRNA agarose gel electrophoresis；B.Electrophoregram statistics.*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

圖2 感染后不同時(shí)間點(diǎn)C3H和C57小鼠肺組織MyD88 mRNA表達(dá)Fig.2 Expression of MyD88 mRNA in lung from C3H and C57 mice post infectionNote:A.mRNA agarose gel electrophoresis;B.Electrophoregram statistics.**.P<0.01;***.P<0.001.

3 討論

有研究表明不同遺傳背景的小鼠對(duì)衣原體生殖道感染的易感性不同，C3H小鼠是衣原體感染易感表型，C57小鼠是抵抗表型[2]。有研究表明TNF-α[8]、IL-1β[9]和IL-6[10]在衣原體感染中表達(dá)增加，加重了小鼠的疾病狀況。本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體經(jīng)呼吸道感染小鼠后C3H小鼠肺組織有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，與C57小鼠相比病理反應(yīng)較重，結(jié)果表明與C3H小鼠體內(nèi)高表達(dá)的前炎癥性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6以及CXC趨化因子及其受體CXCR-2密切相關(guān)，在敲除CXCR-2基因后，Cm感染后小鼠肺組織中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)減少[3]，Darville等[11]在衣原體生殖道感染模型中也闡述了巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2(Macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)表達(dá)與中性粒細(xì)胞在感染部位浸潤(rùn)的關(guān)系。但是過(guò)度的中性粒胞浸潤(rùn)未能有效地清除衣原體，反而造成C3H小鼠嚴(yán)重的肺組織病理?yè)p傷。

Toll樣受體等固有免疫細(xì)胞表面表達(dá)的模式識(shí)別受體與病原體的結(jié)合可促進(jìn)前炎癥因子的產(chǎn)生[1]，轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白MyD88分子則可以與大部分TLR結(jié)合，直接或間接地影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答[12]。衣原體主要刺激TLR2和TLR4引起宿主免疫應(yīng)答[13]。在沙眼衣原體小鼠生殖道感染模型中，TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)增加，誘導(dǎo)炎癥因子分泌增多[5]，使用藥物抑制TLR2和TLR4表達(dá)后疾病嚴(yán)重程度減輕[10]。在沙眼衣原體生殖道感染中，MyD88分子可以促進(jìn)固有免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，敲除MyD88分子后，小鼠不能夠有效地清除病原體[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，與C57小鼠相比，Cm呼吸道感染后C3H小鼠體內(nèi)TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)上調(diào)，且在感染后第14天仍有高水平表達(dá)，與前炎癥因子表達(dá)[3]保持一致，疾病表現(xiàn)更加嚴(yán)重。有研究表明肺炎衣原體感染后主要是被TLR2識(shí)別，繼而激活炎癥反應(yīng)，本研究中C3H小鼠肺組織中TLR2表達(dá)增高更加明顯，與相關(guān)報(bào)道相符 ，說(shuō)明Cm呼吸道感染后主要是C3H小鼠體內(nèi)過(guò)度表達(dá)的TLR2誘導(dǎo)過(guò)度的炎癥反應(yīng)[15]。

綜上所述，沙眼衣原體小鼠肺炎菌株通過(guò)呼吸道感染小鼠后，C3H小鼠體內(nèi)TLR2以及下游受體蛋白MyD88表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)相應(yīng)前炎癥因子分泌增多與C3H和C57小鼠對(duì)沙眼衣原體呼吸道感染的易感性不同密切相關(guān)。

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