王 榮 覃海媚 黃華佗 陸玉蘭 郭 靜 藍(lán) 艷 王俊利 韋葉生

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，百色 533000)

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性的小分子非編碼RNA，可通過和靶mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合后降低其穩(wěn)定性或抑制翻譯，從而調(diào)控基因表達(dá)[1]。免疫細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化等過程受到miRNA的調(diào)控。miR-17-92是影響淋巴細(xì)胞形成的關(guān)鍵基因簇，這些細(xì)胞是自身免疫性疾病、腫瘤及炎癥反應(yīng)等的重要基礎(chǔ)[2，3]。啟動子單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位點是疾病易感性探索的優(yōu)先選擇對象[4]。目前，尚未見miR-17-92啟動子多態(tài)性與淋巴細(xì)胞間關(guān)系的研究。因此，我們檢測次要等位基因(MAF)>10%的rs9515692C/T和rs1352743A/G基因型，分析其多態(tài)性在不同人群中的差異和淋巴細(xì)胞數(shù)關(guān)系，為國內(nèi)人群SNP分布資料及深入研究與免疫相關(guān)疾病關(guān)系提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取來自我院的275例無親緣關(guān)聯(lián)的廣西健康體檢者，包括男性98例及女性177例，年齡17～78歲。所有對象的臨床檢查和實驗室檢測指標(biāo)均正常。研究方案獲得本院的倫理委員會審批，研究對象對研究內(nèi)容知情同意并簽署同意書。

1.2方法

1.2.1DNA提取 用EDTA-K2的血液采集管抽取受試者的肘正中靜脈血3 ml。取其中的200 μl血液按天根(北京)公司血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，置于-20℃保存待用。

1.2.2引物合成 參考GenBank中的基因序列，本實驗引物在Primer3.0在線軟件(http://primer3.ut.ee/)進(jìn)行，交由上海天昊生物科技有限公司合成。rs9515692C/T上游引物：5′-GGAAACAACCTGGAGGCTCTTCAA-3′，下游引物：5′-TTTCCTCTAACCTGAACCCCTGTCT-3′，延伸引物：5′-TTTTTTT-TTTTTTTCCAGTGATTTTCCTTATTACTGCTGA-3′；rs1-352743A/G上游引物:5′-TTGCTGACCGTAATCA-GCCACAT-3′，下游引物：5′-GGCAAACGACCACAGAGGAAAT-3′，延伸引物：5′-TTTTTTTTTTTT-TTTTTTTTTTTTTTTTCCTCATTATTTTTAGTAAAAGG-GTTGA-3′。

1.2.3基因分型 PCR擴增體積共20 μl，有1.0 μl 樣本DNA、2.0 μl緩沖液、2.0 μl dNTPs、1 U TapDNA聚合酶及上、下游引物各1.0 μl，其余體積用雙蒸水補足。PCR反應(yīng)步驟：95℃ 2 min,94℃ 20 s、65℃ 40 s、72℃ 1.5 min，循環(huán)35次。72℃平衡 2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化進(jìn)行延伸。純化的延伸產(chǎn)物在ABI 3730XL測序儀檢測，所得數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1作分析。DNA測序法進(jìn)一步驗證上述分型結(jié)果。

1.2.4淋巴細(xì)胞檢測 抽取研究對象靜脈血，取流式細(xì)胞儀專用試管加入已采集的抗凝血50 μl，采用對應(yīng)的試劑盒在BD FACSCantoⅡ全自動流式細(xì)胞儀測試。

2 結(jié)果

2.1rs9515692C/T和rs1352743A/G基因分型 經(jīng)檢驗2個SNP位點的基因型頻率符合Hardy-Weinberg法則(P=0.194;P=0.409，P均>0.05)，說明人群有代表性。檢測結(jié)果表明，rs9515692C/T存在3種基因型：CC(65.8%)、CT(29.1%)、TT(5.1%)；rs1352743A/G也存在3種基因型：AA(12.7%)、AG(49.1%)、GG(38.2%)。DNA測序結(jié)果與分型結(jié)果一致，見圖1、2。

2.2廣西人群中2位點的基因多態(tài)性分布 統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn) rs9515692C/T和rs1352743A/G基因型以及等位基因頻率在男、女性之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3各位點多態(tài)性與其他人群間比較 廣西人群rs9515692C/T和rs1352743A/G基因型及等位基因分布頻率同歐洲、日本和非洲人群相比，顯示差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與北京人相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2、3。

2.4各位點基因型與淋巴細(xì)胞的關(guān)系 統(tǒng)計分析基因型及模型的研究對象間年齡和性別的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。rs9515692C/T基因型間的B淋巴細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B淋巴細(xì)胞數(shù)在CC/CT和TT比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。rs1352743A/G基因型間、顯性模型和隱性模型的淋巴細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

圖1 miR-17-92 基因簇rs9515962C/T位點測序圖Fig.1 Sequencing map of genotype for miR-17-92 gene cluster rs9515692C/T polymorphismNote:The inverted triangles of panels ①-③ indicated CC，CT and TT genotypes,respectively.

圖2 miR-17-92 基因簇rs1352743A/G位點測序圖Fig.2 Sequencing map of genotype for miR-17-92 gene cluster rs1352743A/G polymorphismNote:The inverted triangles of panels ①-③ indicated AA，AG and GG genotypes,respectively.

表1廣西人群中rs9515692C/T、rs1352743A/G基因型及等位基因頻率的分布

Tab.1Distributionofgenotypeandallelefrequenciesofrs9515692C/Tandrs1352743A/GinGuangxipopulation

GendernGenotypefrequency(%)CC(AA)CT(AG)TT(GG)Allelefrequency(%)C(A)T(G)rs9515692C/TMale9863(643)30(306)5(51)156(796)40(204)Female177118(667)50(282)9(51)286(808)68(192)Total275181(658)80(291)14(51)442(804)108(196)rs1352743A/GMale9811(112)53(541)34(347)75(383)121(617)Female17724(136)82(463)71(401)130(367)224(633)Total27535(127)135(491)105(382)205(373)345(627)

Note：Genotype and allele frequencies of rs9515692C/T and rs1352743A/G showed no significant difference between male and female(P>0.05).

表2廣西人群中rs9515692C/T基因型和等位基因分布頻率與其他種族的比較

Tab.2Comparisonoffrequencyofrs9515692C/TpolymorphisminGuangxipopulationandotherethnicgroups

PopulationsnGenotypefrequency(%)CCCTTTAllelefrequency(%)CTGuangxipeople275181(658)80(291)14(51)442(804)108(196)HapMap?CEU1)22674(327)122(539)30(134)270(597)182(403)HapMap?HCB8654(628)28(326)4(46)136(791)36(209)HapMap?JPT1)17290(523)74(431)8(46)254(738)90(262)HapMap?YRI1)224162(723)60(268)2(09)384(857)60(143)

Note：1) Genotype and allele frequencies,bothP<0.05,compared with the Guangxi people.

表3廣西人群rs1352743A/G基因型和等位基因分布頻率與其他種族的比較

Tab.3Comparisonoffrequencyofrs9515692C/TpolymorphisminGuangxipopulationandotherethnicgroups

PopulationsnGenotypefrequency(%)AAAGGGAllelefrequency(%)AGGuangxipeople27535(127)135(491)105(382)205(373)345(627)HapMap?CEU1)226104(460)104(460)18(80)312(690)140(310)HapMap?HCB8416(190)42(500)26(310)74(440)94(560)HapMap?JPT1)17254(314)92(535)26(151)200(581)144(419)HapMap?YRI1)226150(664)62(274)14(62)362(801)90(199)

Note：1) Genotype and allele frequencies,bothP<0.05,compared with the Guangxi people.

表4miR-17-92基因rs9515692C/T基因型的淋巴細(xì)胞數(shù)比較

Tab.4Comparisonofnumberoflymphocytesingenotypesofrs9515692C/TinmiR-17-92

GenotypeThCTLBTh/CTLCC1)77731±2034753369±1662024788±7436153±042CT1)80533±1993151443±1749126686±7174171±053TT1)67700±1234744050±706717833±6281160±045Dominant77681±1909149800±1596124719±7826168±051Recessive1)79322±1987952276±1691125864±7249163±049

Note：1) The number of B lymphocytes showed significant difference in genotypes and recessive model,bothP<0.05.

表5miR-17-92基因rs1352743A/G基因型的淋巴細(xì)胞數(shù)比較

Tab.5Comparisonofnumberoflymphocytesingenotypesofrs1352743A/GinmiR-17-92

GenotypeThCTLBTh/CTLGG79118±1827154118±1767225014±6686156±046AG76375±1883751083±1595425808±8444163±052AA76000±2419043878±1040822667±8978178±048Dominant76214±2071947995±1402424462±8602170±050Recessive78150±1823453047±1690425294±7236159±048

Note：The number of lymphocytes showed no significant difference in genotypes,dominant model and recessive model,bothP>0.05.

3 討論

啟動子是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄起始時間和表達(dá)的程度。啟動子區(qū)SNPs可影響基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致與之相關(guān)疾病的發(fā)生[5，6]。我們的結(jié)果表明，廣西人群miR-17-92的rs9515692C/T和rs1352743A/G多態(tài)性與性別無關(guān)(P>0.05)。而同歐洲、日本以及非洲人比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，和北京人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這也符合基因多態(tài)性的“親緣關(guān)系”。即廣西人、北京人的親緣關(guān)系，地理環(huán)境相對較近，基因多態(tài)性分布差異??；與歐洲人、日本人、非洲人的親緣關(guān)系、地理環(huán)境較遠(yuǎn)，基因多態(tài)性分布差異大。此外，還可能和飲食習(xí)慣、生活環(huán)境和自然選擇等因素有關(guān)[7]。提示在疾病的遺傳學(xué)研究時應(yīng)該結(jié)合地區(qū)和種族因素選擇研究對象，不同人群的基因數(shù)據(jù)只宜作參照。

miR-17-92位于人類第13號染色體上(13q31-32)，其轉(zhuǎn)錄前體含有6個串聯(lián)莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)[8]。越來越多的研究證實miRNA的SNPs通過調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)或可參與導(dǎo)致腫瘤的形成。研究表明，microRNA啟動子區(qū)SNP可直接引起microRNA表達(dá)降低或增加[9，10]。Jia等[11]發(fā)現(xiàn)miR-146a中rs2910164位點CC基因型和C等位基因與中國人患非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險性密切有關(guān)。然而，Hong等[12]發(fā)現(xiàn)rs2910164與韓國人的非小細(xì)胞肺癌患病風(fēng)險無關(guān)。這些研究的研究對象來源不同，推測這種差異可能是導(dǎo)致疾病易感性結(jié)論不同的原因之一。至今，雖未見miR-17-92多態(tài)性和疾病易感性關(guān)系的報道。本研究開展對廣西人群miR-17-92基因簇rs9515692C/T和rs1352743A/G多態(tài)性研究，并和不同人群進(jìn)行比較。這正好為miR-17-92多態(tài)性群體遺傳學(xué)普查提供了資料，也對今后探索多態(tài)性和疾病的關(guān)系起到指導(dǎo)作用。本研究發(fā)現(xiàn)rs9515692C/T多態(tài)性和B淋巴細(xì)胞數(shù)相關(guān)。因此，在以后探討和免疫相關(guān)疾病的關(guān)系時，建議可優(yōu)先選取rs9515692C/T位點。

本研究實施廣西人群的miR-17-92基因簇啟動子的單核苷酸多態(tài)性研究，比較不同人群的分布情況，發(fā)現(xiàn)rs9515692C/T和rs1352743A/G多態(tài)性在不同人群間存在差異。此外，rs9515692C/T多態(tài)性還與B淋巴細(xì)胞數(shù)存在相關(guān)性。因此，進(jìn)一步研究miR-17-92多態(tài)性和免疫相關(guān)性疾病的關(guān)系是未來的新方向。但是，本研究樣本量較小，結(jié)果僅具有區(qū)域代表性，仍需大樣本和多地區(qū)實施研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Paul P,Chakraborty A,Sarkar D,etal.Interplay between miRNAs and Human Diseases[J].J Cell Physiol,2018,233(3):2007-2018.

[2] Gu H,Liu Z,Zhou L.Roles of miR-17-92 cluster in cardiovascular development and common diseases[J].Biomed Res Int，2017,2017:9102909.

[3] Lai M,Xiao C.Functional interactions among members of the miR-17-92 cluster in lymphocyte development,differentiation and malignant transformation[J].Int Immunopharmacol,2015,28(2):854-858.

[4] 魯明騫,孔慶志,許新華,等.鼻咽癌MKK4蛋白表達(dá)與-1044A/T多態(tài)性的相關(guān)性分析[J].中國免疫學(xué)雜志,2016,32(8):1137-1140.

Lu MS,Kong QZ,Xu XH,etal.Correlation between MKK4 protein expression and -1044A/T polymorphism in Nasopharyngeal carcinoma[J].Chin J Immunol,2016,32(8):1137-1140.

[5] Liu Q,Yang G,Song XL,etal.Association between rs4938723 functional polymorphism in the promoter region of miR-34b/c gene and cancer risk[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol,2015,39(4):526-533.

[6] Wang S,Cao X,Ding B,etal.The rs767649 polymorphism in the promoter of miR-155 contributes to the decreased risk for cervical cancer in a Chinese population[J].Gene,2016,595(1):109-114.

[7] 郭 靜,向 陽,彭友帆,等.廣西人群中IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G多態(tài)性的分布特點[J].中國免疫學(xué)雜志,2016,32(6):849-852.

Guo J,Xiang Y,Peng YF,etal.Distribution characteristics of rs10975521A/T and rs1929992A/G polymorphism of IL-33 gene in Guangxi population[J].Chin J Immunol,2016,32(6):849-852.

[8] Ota A,Tagawa H,Karnan S,etal.Identification and characterization of a novel gene,C13orf25,as a target for 13q31-q32 amplification in malignant lymphoma[J].Cancer Res,2004,64(9):3087-3095.

[9] Wei L,Zhou Q,Hou S,etal.MicroRNA-146a and Ets-1 gene polymorphisms are associated with pediatric uveitis[J].PLoS One,2014,9(3):e91199.

[10] Cui L,Li Y,Ma G,etal.A functional polymorphism in the promoter region of microRNA-146a is associated with the risk of Alzheimer disease and the rate of cognitive decline in patients[J].PLoS One,2014,9(2):e89019.

[11] Jia Y,Zang A,Shang Y,etal.MicroRNA-146a rs2910164 polymorphism is associated with susceptibility to non-small cell lung cancer in the Chinese population[J].Med Oncol,2014,31(10):194.

[12] Hong MJ,Choi YY,Jang JA,etal.Association between genetic variants in pre-microRNAs and survival of early-stage NSCLC[J].J Thorac Oncol,2013,8(6):703-710.