何 霞 崔 璨 陳 敏

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

腦梗死屬于神經(jīng)內(nèi)科高發(fā)疾病，占腦血管疾病的75.0%，發(fā)病早期治療措施不當(dāng)臨床死亡率將超過10.0%[1]。腦梗死發(fā)病機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，普遍認(rèn)為是由于腦血管供應(yīng)發(fā)生障礙，造成腦部出現(xiàn)缺血、缺氧，從而引起腦部組織發(fā)生局限性壞死、腦軟化，其病因較多，包括動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等，嚴(yán)重影響我國(guó)居民健康[2]。目前，臨床上對(duì)于腦梗死以超早期溶栓、腦神經(jīng)保護(hù)等治療為主，該方案雖然能降低臨床死亡率，延緩病情發(fā)展，但是臨床治療預(yù)后較差，存活患者中仍然有50.0%～70.0%患者伴有不同程度的后遺癥，難以達(dá)到預(yù)期治療效果[3]。生物學(xué)研究認(rèn)為：成熟的神經(jīng)元由于特殊的結(jié)構(gòu)，當(dāng)期發(fā)生受損后將無(wú)法再生[4]，因此腦梗死患者發(fā)病后由于神經(jīng)元發(fā)生壞死性缺血，成為治療發(fā)病后殘疾的重要原因。

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，干細(xì)胞在腦梗死中得到應(yīng)用，對(duì)于其基礎(chǔ)、臨床前期研究獲得的成果相對(duì)較多[5]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞屬于特殊的干細(xì)胞，具有取材方便、免疫原性低、能自體移植等特點(diǎn)，成為腦梗死治療的首選干細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[6]：將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于腦梗死中有助于促進(jìn)腦梗死神經(jīng)功能恢復(fù)，并且該治療方法是有效的，能為腦梗死臨床治療提供新的方法。文獻(xiàn)報(bào)道顯示：腦梗死能誘發(fā)自身內(nèi)源性神經(jīng)干/前體細(xì)胞的增殖，細(xì)胞能自發(fā)移植到梗死病灶周圍，在多種酶作用下向神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞分化[7]。但是，多數(shù)增殖的內(nèi)源性神經(jīng)干/前體細(xì)胞存活周期較短，難以對(duì)腦梗死的治療發(fā)揮實(shí)質(zhì)性作用[8]。研究表明[9]：將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)性SD大鼠腦梗死中有助于提高機(jī)體免疫，降低炎性反應(yīng)，但是不同學(xué)者試驗(yàn)結(jié)果存在爭(zhēng)議。因此，本課題以2015年3月～2017年5月實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的SD大鼠65例作為研究對(duì)象，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血性腦梗死免疫炎性反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 以2015年3月～2017年5月進(jìn)行隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)的SD大鼠65例作為研究對(duì)象，清潔級(jí)。65只SD大鼠體質(zhì)量67.3～91.5 g，平均(77.45±4.75)g，所選動(dòng)物均由醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：scxk2008-0020。研究中對(duì)于SD大鼠的處理均符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)下意見》原則[10]，飼養(yǎng)時(shí)控制實(shí)驗(yàn)室恒溫(20±2)℃，恒濕 50%～60%，大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食，實(shí)驗(yàn)均通過醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)同意，在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科完成。

1.1.2主要儀器和試劑 胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶(Amreseo公司，State of Ohio，USA)、多聚甲醛(北京化工廠)、水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)、倒置相差顯微鏡(IX-71-S8F，Olympus，Japan)、高速冷凍離心機(jī) Sigma 1-15K(德國(guó)賽多利斯公司)、手術(shù)器械一套(醫(yī)院提供)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血性腦梗死模型建立 利用改良Zea-longa線栓法阻斷大腦中動(dòng)脈成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血性腦梗死模型。手術(shù)前動(dòng)物禁食、禁飲4 h，根據(jù)無(wú)菌手術(shù)操作進(jìn)行，利用Marker筆在尼龍栓線在距離頭端1.8 cm部位進(jìn)行標(biāo)記，碘伏消毒后備用。利用10.0%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉(劑量0.35 ml/100 g)，待麻醉生效后10 min將大鼠固定在固定板上，去除頸部的毛發(fā)，利用碘伏完成皮膚消毒，從頸部正中作長(zhǎng)為1.5 cm的切口，范圍為頸部到下頜反折部位，剪開闊筋膜，充分暴露右側(cè)胸鎖乳突肌，并且在胸鎖乳突肌、頸前肌群部位向深部分離，暴露頸動(dòng)脈鞘。建模過程中避免損傷迷走神經(jīng)，利用6-0絲線沿著頸外動(dòng)脈和右側(cè)頸總動(dòng)脈離分叉8 mm部位進(jìn)行結(jié)扎，頸內(nèi)動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈僅單一套線不進(jìn)行結(jié)扎，利用血管鉗牽拉頸內(nèi)動(dòng)脈，壓閉頸總動(dòng)脈完成血流的阻斷后控制剪開的右側(cè)頸總動(dòng)脈。在右側(cè)頸總動(dòng)脈分離叉5 mm部位作小切口，置入尼龍線直到頸內(nèi)動(dòng)脈。單結(jié)輕微結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，控制血液反流但是避免栓線阻礙，松開頸內(nèi)動(dòng)脈的牽拉套線，利用顯微鑷子夾住，利用鑷子沿著頸內(nèi)動(dòng)脈方向插入，當(dāng)栓線上標(biāo)記的1.8 cm達(dá)到右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉部位時(shí)停止插入，雙結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈套線，縫合手術(shù)切口，栓線尾端暴露在切口外2 h后拔除1 cm實(shí)現(xiàn)血流的再灌注，剪斷外部栓線，完成實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血性腦梗死模型建立。大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，動(dòng)脈栓塞對(duì)側(cè)肢體不如同側(cè)靈活、跛行視為建模成功[11，12]。

1.2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng) 取5只大鼠，利用1%異戊巴比妥鈉(注射量3 ml/kg)腹腔內(nèi)麻醉，采用斷頸方法處死大鼠，去除雙側(cè)股骨、脛骨及肌肉，剪斷骨骺，充分暴露骨髓腔，利用PBS進(jìn)行沖洗，收集骨髓細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)吹打后制備單細(xì)胞懸液，將其接種在37℃，濃度為5%CO2中連續(xù)培養(yǎng)，24 h后全量換液，以后每周換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合70.0%～80.0%時(shí)，開始傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞備用[13,14]。

1.2.3模型大鼠處理 將建模成功后的大鼠60只，隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組20只。模型組建模成功后僅進(jìn)行血管結(jié)扎，不插入線栓；對(duì)照組在病灶部位注入3 ml等體積PBS；實(shí)驗(yàn)組在病灶部位注入10 μl第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取原切口，在右側(cè)胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)鈍性分離確定右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，利用1 ml注射器進(jìn)行穿刺，沿著頸內(nèi)動(dòng)脈方向注射10 μl(細(xì)胞數(shù)量為1×105個(gè))骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞稀釋液，將預(yù)留絲線收緊后，結(jié)扎右側(cè)頸外動(dòng)脈，止血后完成切口縫合[15]。

1.2.4觀察指標(biāo) ①骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)。取少許分離、培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)[16]。②熒光顯微鏡觀察。取少許分離、培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞數(shù)目，利用離心機(jī)進(jìn)行離心，然后加入CD34-PE單抗、CD44-FITC、CD29-異硫氰熒光素(FITC)進(jìn)行標(biāo)記以及CD45-藻紅蛋白(PE)，在28℃的黑暗條件下進(jìn)行30 min保存，然后在熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白的標(biāo)記率[17]。③神經(jīng)功能評(píng)分。對(duì)大鼠進(jìn)行3個(gè)月試驗(yàn)，參考Longa和Bederson方法對(duì)三組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，采用0～5分制法進(jìn)行評(píng)定，0分：無(wú)神經(jīng)功能癥狀；4分：不能走路且意識(shí)喪失[18]。④炎性因子水平。三組大鼠治療后次日早晨尾靜脈抽取2 ml靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定IL-6、IFN-γ、IL-10及TGF-β水平，有關(guān)操作嚴(yán)格遵循儀器步驟完成[19]。⑤免疫水平。三組大鼠治療后1個(gè)月、2個(gè)月及3個(gè)月采集靜脈血標(biāo)本，血清分離后采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD4+CD25+Tregs細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比[20]。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 本課題中納入65只SD大鼠，所有大鼠均根據(jù)要求完成相關(guān)實(shí)驗(yàn)，中途無(wú)脫落。

2.2分離制備細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下第3天第1代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體積增大，呈多角形或長(zhǎng)梭形，細(xì)胞開始聚集，第3代細(xì)胞迅速增殖，排列具有一定的方向性，呈旋渦狀生長(zhǎng)，并且具有多層，界限不清，見圖1。

2.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞熒光顯微鏡觀察 熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明：獲得細(xì)胞中大部分區(qū)域被熒光標(biāo)記，獲得的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，見圖2。

2.4三組大鼠治療后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較 對(duì)照組與模型組治療后1個(gè)月、2個(gè)月及3個(gè)月神經(jīng)功能評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組后1個(gè)月、2個(gè)月及3個(gè)月神經(jīng)功能評(píng)分，低于對(duì)照組與模型組(P<0.05)，見表1。

2.5三組大鼠治療后3個(gè)月炎癥因子水平比較 對(duì)照組與模型組IL-6、IFN-γ、IL-10及TGF-β水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組治療后3個(gè)月IL-6、IFN-γ水平，高于對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組治療后3個(gè)月IL-10及TGF-β水平，低于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞倒置顯微鏡形態(tài)(×200)Fig.1 Bone marrow mesenchymal stem cells inverted microscope morphology(× 200)Note:Fig.A shows the first generation of bone marrow mesenchymal stem cell morphology;Fig.B shows the third generation of bone marrow mesenchymal stem cell morphology.

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞熒光顯微鏡觀察(×400)Fig.2 Fluorescence microscopy of bone marrow mesen-chymal stem cells(× 400)Note:Most of the area in the figure is covered by blue fluorescence.

Groupsn1month2months3monthsObservationgroup20231±0891)2)184±0731)2)084±0211)2)Controlgroup20302±094231±084155±034Modelgroup20304±096233±085157±036

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

GroupsnIL?6(ng/L)IFN?γ(ng/L)IL?10(ng/L)TGF?β(ng/L)Observationgroup2055948±24361)2)3232±4361)2)848±2311)2)4039±4511)2)Controlgroup2045832±21191483±3911583±4035325±604Modelgroup2045081±19881302±3261604±4055838±653

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

Groupsn1month2months3monthsObservationgroup20746±4351)2)1325±4621)2)1683±4711)2)Controlgroup20542±231894±3471093±404Modelgroup20541±229893±3411089±401

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

2.6三組大鼠治療后不同時(shí)間點(diǎn)免疫水平比較 三組大鼠治療后免疫水平均得到明顯提高；對(duì)照組與模型組免疫水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組大鼠治療后1個(gè)月、2個(gè)月及3個(gè)月CD4+CD25+Tregs細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比，高于對(duì)照組與模型組(P<0.05)，見表3。

3 討論

根據(jù)我國(guó)第三次全國(guó)死亡病因調(diào)查結(jié)果表明：腦血管疾病已經(jīng)成為威脅我國(guó)居民健康的首要死亡原因，占死亡總數(shù)的22.45%，屬于是一種單病種致死、致殘率較高的疾病，嚴(yán)重影響我國(guó)居民健康及生活[21]。腦梗死占腦血管病的70.0%，且對(duì)于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家甚至達(dá)到85.0%，因此，加強(qiáng)腦梗死的防治對(duì)改善預(yù)后具有重要的意義[22]。目前，臨床上對(duì)于腦梗死以溶栓治療為主，該方案雖然能延緩疾病發(fā)展，但是治療時(shí)間窗過短，符合溶栓治療適應(yīng)證患者相對(duì)較少，治療時(shí)容易增加顱內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)[23]。

干細(xì)胞可以分為胚胎干細(xì)胞與成體干細(xì)胞兩種[24]。胚胎干細(xì)胞屬于是一種高度未分化的細(xì)胞，具備發(fā)育全能性，能分化出所有成體動(dòng)物的組織、器官。而成體干細(xì)胞則具備與胚胎干細(xì)胞相類似的分化能力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于特性相對(duì)穩(wěn)定，來源充足，易于冷凍保存及體外擴(kuò)增，細(xì)胞具備較強(qiáng)的自我更新、多向分化潛能，能分泌大量生長(zhǎng)因子，有助于促進(jìn)血管的生成和再生[25]。因此，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞屬于組織工程中離心的“種子細(xì)胞”。本課題中，采用貼壁法能完成大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離制備，結(jié)果表明：倒置顯微鏡下第3天第1代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體積增大，呈多角形或長(zhǎng)梭形，細(xì)胞開始聚集，第3代細(xì)胞迅速增殖，排列具有一定的方向性，呈旋渦狀生長(zhǎng)，并且具有多層，界限不清；熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明：獲得細(xì)胞中99%被熒光標(biāo)記，獲得的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。提示采用貼壁法能實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、提取和制定，并且經(jīng)過對(duì)細(xì)胞鑒定后看出：制備培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，能為后續(xù)試驗(yàn)的順利開展奠定基礎(chǔ)。國(guó)外學(xué)者研究表明：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于腦梗死具有神經(jīng)保護(hù)作用，有助于提高機(jī)體免疫，降低炎癥因子水平[26]。因此，本課題中以大鼠作為研究對(duì)象，利用改良Zea-longa線栓法阻斷大腦中動(dòng)脈成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血性腦梗死模型，該建模方法相對(duì)簡(jiǎn)單，能獲得較高的成功率，并且建模對(duì)于實(shí)驗(yàn)室儀器要求較低。

本課題中，將分離制備的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制到實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠中，以PBS及模型組進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組治療后1個(gè)月、2個(gè)月及3個(gè)月神經(jīng)功能評(píng)分，低于對(duì)照組與模型組(P<0.05)。提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的使用有助于改善大鼠神經(jīng)功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血性腦梗死模型中機(jī)制如下：(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植能促進(jìn)神經(jīng)功能再生，能維持缺血神經(jīng)細(xì)胞的存活，從而促進(jìn)神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)。國(guó)內(nèi)學(xué)者試驗(yàn)表明：腦缺血模型大鼠移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后在血清中存在諸多促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的再生細(xì)胞因子，利于大鼠神經(jīng)功能缺損的修復(fù)[27]。(2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植有助于促進(jìn)血管的再生，能提高內(nèi)源性血管生成因子的表達(dá)，從而提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，緩解腦局部缺血、缺氧[28]；(3)腦梗死大鼠建模后神經(jīng)元細(xì)胞通過缺血后再灌注方式發(fā)生凋亡，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的抑制則能延緩凋亡的周期，緩解氧化應(yīng)激引起的自由基損傷[29]。(4)腦梗死的發(fā)生、發(fā)展屬于是一個(gè)多因素過程，涉及免疫炎癥反應(yīng)，該反應(yīng)是由于浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞共同作用引起，能產(chǎn)生炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子，包括：IL-6、IFN-γ、IL-10及TGF-β等，而移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞則能減少由于腦梗死引起的炎癥因子，有助于調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，減輕局部免疫炎癥反應(yīng)，利于神經(jīng)功能早期恢復(fù)[30]。本研究中，實(shí)驗(yàn)組治療后3個(gè)月IL-6、IFN-γ水平，高于對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組治療后3個(gè)月IL-10及TGF-β水平，低于對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組大鼠治療后1個(gè)月、2個(gè)月及3個(gè)月CD4+CD25+Tregs細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比，高于對(duì)照組與模型組(P<0.05)。提示：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的抑制有助于降低炎癥反應(yīng)，提高神經(jīng)功能恢復(fù)。目前普遍認(rèn)為，腦梗死后由浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等觸發(fā)的免疫炎性反應(yīng)，而氧化應(yīng)激、程序性細(xì)胞死亡等在缺血性腦梗死中均發(fā)揮重要作用。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植則能促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的釋放，能減輕缺血再灌注損傷，發(fā)揮移植免疫性炎性反應(yīng)作用，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。Treg細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的一個(gè)子集，有特殊的免疫調(diào)制機(jī)制，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要的作用，能維持自身免疫穩(wěn)態(tài)、防止自身免疫疾病的發(fā)生。CD4+CD25+Tregs屬于是重要的CD4+細(xì)胞亞群，能表達(dá)CD25及特異性核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，有效地抑制免疫炎性反應(yīng)，從而產(chǎn)生免疫耐受。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植則能有效地改善腦梗死引起的腦損傷，有助于調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。

綜上所述，利用改良Zea-longa線栓法阻斷大腦中動(dòng)脈成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血性腦梗死模型，采用貼壁法能完成大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離制備，移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有助于調(diào)節(jié)大鼠免疫，降低炎癥因子水平，能為腦梗死治療提供思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李晨光，闕嘉麗，劉可嘉，等.Netrin-1對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦梗死后同側(cè)丘腦血腦屏障保護(hù)作用[J].中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志，2017，43(03):141-146.

Li CG,Zhai JL,Liu KJ,etal.The protective effect of Netrin-1 on thalamus cerebral blood barrier after experimental cerebral infarction in rats[J].Chin J Nervous Mental Dis,2017,43(03):141-146.

[2] 陳 佳，梁燕玲，鄭 翾，等.超聲介導(dǎo)微泡攜帶激肽原酶靶向治療技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性腦梗死后神經(jīng)再生及血管新生的影響[J].中華神經(jīng)科雜志，2015，48(1):55-60.

Chen J,Liang YL,Zheng Z,etal.Effects of ultrasound-mediated microbubble-targeted therapy with kallikrein on neuroregeneration and angiogenesis after experimental acute cerebral infarction[J].Chin J Neurol,2015,48 (1):55-60.

[3] Panahpour H，Golmohammadi M，Mohamadnejad S.Effects of the treatment with nigella sativa oil on brain injury and edema in experimental model of stroke in rats[J].Behavioural Pharma，2015，16(3):56-61.

[4] 孫晶晶，宋乃光，張耀龍，等.高壓氧治療促進(jìn)腦梗死模型大鼠神經(jīng)再生微環(huán)境及神經(jīng)功能的恢復(fù)[J].中國(guó)組織工程研究，2015，19(40):6460-6464.

Sun JJ,Song NG,Zhang YL,etal.Hyperbaric oxygenation promotes the recovery of neural regeneration microenvironment and neurological function in rats with cerebral infarction[J].J Chin Organizational Engineering Res ,2015,19(40):6460-6464.

[5] 王 芳，湯永紅，楊 科，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦缺血損傷和IL-10、TGF-β1表達(dá)的影響[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2016，24(8):788-792.

Wang F,Tong YH,Yang K,etal.Effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on cerebral ischemic injury and expression of IL-10 and TGF-β1 in rats[J].Chin J Arteriosclerosis,2016,24(8): 788-792.

[6] 郭淑娟，王琮民.局灶性腦缺血再灌注大鼠腦損傷與半暗帶鋅離子水平的關(guān)系研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2016，45(15):2055-2057.

Guo SJ,Wang XM.Relationship between brain injury and penumbra zinc level in focal cerebral ischemia-reperfusion rats[J].Chongqing Med J ,2016,45(15):2055-2057.

[7] Bleilevens C，Roehl AB，Zoremba N，etal.Insular infarct size but not levosimendan influenced myocardial injury triggered by cerebral ischemia in rats[J].Exp Brain Res，2015，233(1):149-156.

[8] 孫而藝，張 旋，楊 陽(yáng)，等.二十二碳六烯酸誘導(dǎo)細(xì)胞自噬減輕缺血性腦卒中神經(jīng)損傷[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，39(14):1452-1457.

Sun EY,Zhang X,Yang Y,etal.Docosahexaenoic acid-induced autophagy in reducing ischemic stroke neurological injury[J].Third Military Med Univ,2017,39(14):1452-1457.

[9] 阮名花，鄒贏鋅，欒 潔，等.核黃素抑制大鼠缺血性腦損傷[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2016，32(8):1115-1121.

Ruan MH,Zou YX,Yu J,etal.Riboflavin inhibits ischemic brain injury in rats[J].Chin Pharmacologl Bulletin,2016,32(8):1115-1121.

[10] Camposmartorell M，Canosarabia M，Simats A，etal.Charge effect of a liposomal delivery system encapsulating simvastatin to treat experimental ischemic stroke in rats[J].Int J Nanomed，2016，11(default):3035-3048.

[11] 王玉凱，任 麗，黃銘娜，等.電針治療大鼠急性缺血性腦損傷的作用機(jī)制[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2015，37(4):247-251.

Wang YK,Ren L,Huang MN,etal.Effects of electroacupuncture on acute ischemic brain injury in rats[J].Chin J Physical Med Rehabil,2015,37(4):247-251.

[12] 何 堅(jiān)，黃紫妍，陳偉標(biāo)，等.電針抑制局灶性腦缺血損傷大鼠皮質(zhì)細(xì)胞自噬的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2015，30(12):1203-1207.

He J,Huang ZX,Chen WB,etal.Effects of electroacupuncture on autophagy of cortical cells in focal cerebral ischemic injury rats[J].Chin J Rehabil Med,2015,30(12):1203-1207.

[13] 趙 梅，郭振豐，李天時(shí)，等.丹參酮ⅡA對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌梗死心律失常機(jī)制研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2016，36(17):1452-1455.

Zhao M,Guo ZF,Li TS,etal.Mechanism of arrhythmia induced by tanshinone IIA in experimental myocardial infarction in rats[J].Chin J Hospital Pharmacy,2016,36(17):1452-1455.

[14] Camposmartorell M，Canosarabia M，Simats A，etal.Charge effect of a liposomal delivery system encapsulating simvastatin to treat experimental ischemic stroke in rats[J].Int J Nanomed，2016，11(default):3035-3048.

[15] 李 麗，王林萍.雞血藤總黃酮對(duì)大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用[J].中成藥，2015，37(10):2303-2306.

Li L,Wang LP.Protective effects of total flavonoids from Spatholobus suberectus on acute myocardial ischemia in rats[J].Chin Tradition Patent Med,2015,37(10):2303-2306.

[16] 吳 瓊，蔡智慧，王振全，等.美滿霉素聯(lián)合梔子苷對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].解剖學(xué)雜志，2017，40(3):283-285.

Wu Q,Cai ZH,Wang ZQ,etal.Protection of minocycline combined with geniposide on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J].Chin J Anatomy,2017,40(3):283-285.

[17] Gory B，Chauveau F，Bolbos R，etal.Spatiotemporal characterization of brain infarction by sequential multimodal MR imaging following transient focal ischemia in a Rat model of intra-arterial middle cerebral artery occlusion[J].Eur Rad，2016，26(12):1-10.

[18] 包新杰，李雪元，左賦興，等.穩(wěn)定的大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞腦梗死模型的建立[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2016，24(4):395-398.

Bao XJ,Li XY,Zuo FX,etal.Establishment of stable cerebral infarction model for middle cerebral artery occlusion in rats[J].Chin J Lab Animals,2016,24(4):395-398.

[19] 姜 炎，連亞軍.鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)急性腦梗死大鼠炎性因子與神經(jīng)功能的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2016，33(7):1819-1821.

Jiang Y,Lian JJ.Effect of murine nerve growth factor on inflammatory factors and neurological function in rats with acute cerebral infarction[J].Chin J Exp Surg,2016,33(7):1819-1821.

[20] Cao XL，Du J，Zhang Y，etal.Hyperlipidemia exacerbates cerebral injury through oxidative stress，inflammation and neuronal apoptosis in MCAO/reperfusion rats[J].Exp Brain Res，2015，233(10):2753.

[21] 劉慧影，王鵬琴，邊 穎，等.眼針干預(yù)腦缺血再灌注模型大鼠神經(jīng)功能及相關(guān)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)[J].中國(guó)組織工程研究，2016，20(18):2634-2641.

Liu HY,Wang PQ,Bian Y,etal.Effects of ocular acupuncture on neurological function and related neurotrophic factor expression in rat model of cerebral ischemia-reperfusion[J].J Chin Organizational Engineer Res,2016,20(18):2634-2641.

[22] 石秋艷，陳 歷，劉愛東，等.觀察遠(yuǎn)隔肢體缺血對(duì)大鼠急性腦梗死再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制的探討[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，42(11):2042-2044.

Shi QY,Chen L,Liu AD,etal..Protective effects and mechanisms of distal limb ischemia on acute cerebral infarction reperfusion injury in rats[J].Modern Prevent Med,2015,42(11):2042-2044 .

[23] Sang H，Liu L，Wang L，etal.Opposite roles of bradykinin B1 and B2 receptors during cerebral ischaemia-reperfusion injury in experimental diabetic rats[J].Eur J Neurosci，2016，43(1):53.

[24] 王鈺瑩，粟 旭，劉 波，等.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞原位移植治療大鼠腦梗死[J].中國(guó)組織工程研究，2017，21(09):1414-1419.

Wang YY,Su X,Liu B,etal.Treatment of cerebral infarction in rats with orthotopic transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells[J].J Chin Organizational Engineering Res,2017,21(9):1414-1419.

[25] 林亞南，程敬亮，張 勇，等.大鼠腦梗死后交叉性小腦神經(jīng)機(jī)能聯(lián)系不能的DTI評(píng)價(jià)[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)影像雜志，2017，28(4):240-244.

Lin YN,Cheng JL,Zhang Y,etal.DTI evaluation of cross-cerebellar cerebellar neuropathia after cerebral infarction in rats[J].Chin J Clin Med Imag,2017,28(4):240-244.

[26] Sun S，Chen X，Yang G，etal.Mn-SOD upregulation by electroacupuncture attenuates ischemic oxidative damage via CB1R-Mediated STAT3 phosphorylation[J].Mol Neurobiol，2016，53(1):331.

[27] 路 芳，莫林宏，王 奕.探索學(xué)習(xí)環(huán)境對(duì)腦梗死模型大鼠神經(jīng)功能改善作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2016，31(6):637-640.

Lu F,Mo LH,Wang Y,etal.An experimental of the effect of exploring learning enviroment on neurofunction of cerebral infarction rats[J].Chin J Rehabil Med,2016,31(6):637-640.

[28] Liu C，Dong Z，Xu L，etal.MR image features predicting hemorrhagic transformation in acute cerebral infarction:a multimodal study[J].Neuroradiology，2015，57(11):1145-1152.

[29] 楊霄鵬，閆瑩瑩，王一凡，等.丁苯酞對(duì)局灶性腦梗死大鼠氧化應(yīng)激及內(nèi)皮型一氧化氮合酶脫耦聯(lián)的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32(10):2459-2461.

Yang XP,Yan YY,Wang YF,etal.Effect of butylphthalide on oxidative stress and endothelial nitric oxide synthase decoupling of rats with focal cerebral ischemia[J].Chin J Clin Med Imag,2015，32(10):2459-2461.

[30] 陳龍華.磁共振成像觀察SPIO標(biāo)記脂肪干細(xì)胞在腦梗死大鼠腦內(nèi)的遷徙和分布[J].中國(guó)組織工程研究，2016，20(6):793-798.

Chen LH.MRI imaging of the migration and distribution of SPIO-labeled adipose-derived stem cells in brain of rats with cerebral infarction[J].J Chin Organizational Engineer Res,2016,20(6):793-798.