王 倩， 丁 蕾， 祝嫦巍(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

隨著現(xiàn)代紡織工業(yè)的飛速發(fā)展，有機(jī)合成染料被廣泛使用。各種染料隨污水排放，造成水體色度增高，BOD增加，嚴(yán)重污染環(huán)境。另外某些種類(lèi)的染料如偶氮類(lèi)或苯胺類(lèi)還具有致癌、致突變等毒性作用，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。各種染料大都具有復(fù)雜且穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，很難進(jìn)行降解，對(duì)生態(tài)環(huán)境具有很大的負(fù)面影響[1-2]。因此，尋找有效降解染料的方法意義重大。染料廢水的處理方法有多種，傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法包括混凝沉降法、膜分離法、光氧化法、超聲氧化法等等。但用這些方法處理廢水不但付出巨大成本，效率也不高，降解的產(chǎn)物還有可能造成環(huán)境的二次污染，相對(duì)而言運(yùn)用生物酶處理染料廢水具有更好的環(huán)保效果[3-5]。

白腐真菌是一類(lèi)能夠引起木材腐朽降解的絲狀真菌，可以合成多種胞外木質(zhì)素氧化酶包括木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶和漆酶等。同時(shí)白腐真菌對(duì)于各種不同結(jié)構(gòu)的天然及合成化學(xué)物質(zhì)如苯、苯胺、氰化物、多環(huán)芳烴、偶氮染料等都具有的強(qiáng)大降解能力。漆酶作為一種多酚氧化酶，它可催化氧化酚類(lèi)或芳胺類(lèi)等多種底物，同時(shí)分子氧被還原為水，在降解各種有機(jī)污染物(酚類(lèi)和非酚類(lèi)等)及染料脫色方面具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力[6-7]。

漆酶是100多年前由一位日本學(xué)者首先在漆樹(shù)(Rhus vernicifera)中發(fā)現(xiàn)的，其催化底物十分廣泛，且副產(chǎn)物只有水，故被稱(chēng)為“生態(tài)友善的”酶[8]。漆酶在自然界中廣泛存在，不僅分布于真菌和植物中，在昆蟲(chóng)和細(xì)菌等原核生物中也存在漆酶或漆酶類(lèi)似物。其中白腐真菌產(chǎn)生的漆酶被認(rèn)為催化反應(yīng)效果最好，能有效的降解環(huán)境中的多種有機(jī)污染物[9-10]，因而受到廣受關(guān)注。

從安徽科技學(xué)院校園內(nèi)取材而分離得到一株漆酶產(chǎn)生菌，經(jīng)ITS序列比對(duì)分析，該菌屬于栓菌屬(Trametes)，將其命名為T(mén)rametessp. MA-X01。本文探討了該菌所產(chǎn)漆酶對(duì)3種不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的6種染料的脫色能力，以期為染料脫色的生物酶法處理以及在工業(yè)環(huán)保中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試供菌株及培養(yǎng)基 漆酶產(chǎn)生菌株Trametessp. MA-X01(安徽科技學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)中心篩選并保藏)。PDA固體培養(yǎng)基或PDB液體培養(yǎng)基用于菌株常規(guī)保存和培養(yǎng)使用。PDA固體培養(yǎng)基：新鮮去皮土豆200 g煮汁，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g， 瓊脂粉15～20 g，溶化后加水定容至1 000 mL。121℃滅菌30 min。PDB液體培養(yǎng)基：不添加瓊脂，其余成分與PDA相同。

1.1.2 主要試劑 ABTS(2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；香蘭素、丁香酸購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；伊文思藍(lán)、酸性鉻蘭K、酸性紅94、堿性紅2、孔雀石綠、亮綠SF購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。6種染料的結(jié)構(gòu)式如表1所示。

表1 不同染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Table 1 Chemical structure formula of different dyes

1.1.3 儀器 V-1800型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司制造；恒溫?fù)u床：武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司；DNP-9272-1A電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；HH-S3數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠；RJ-TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)：無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液的制備 取4 cm×4 cm左右的新鮮固體培養(yǎng)物均質(zhì)后接種至100 mL液體培養(yǎng)基中，在160 rpm、28℃的恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)7 d。所得發(fā)酵液于4℃、3 000 rpm離心5 min，收集的上清液即為粗酶液。

1.2.2 漆酶活力的測(cè)定 酶活反應(yīng)體系總體積3 mL，其中含2.3 ml 0.2 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=4.5)，0.5 mL粗酶稀釋液和0.2 mL 1 mmol/L ABTS 溶液。測(cè)定反應(yīng)體系在420 nm處吸光值的變化。定義1 min 催化氧化l μmol ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。420 nm處ABTS摩爾消光系數(shù)ε=36 000 /M·cm。

1.2.3 染料的脫色處理 染料脫色反應(yīng)在0.2 mol/L pH=4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液中，避光條件下進(jìn)行，反應(yīng)體系總體積10 mL。在該種染料的最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)初始及每隔一段時(shí)間后的最大吸收值。反應(yīng)體系中，各種染料、反應(yīng)介體等溶液均采用醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.2 mol/L，pH=4.5)進(jìn)行配置或稀釋?zhuān)磻?yīng)體系中介體的終濃度為10 μmol/L。

1.2.4 脫色率的計(jì)算 脫色率(%)=(Ai-Af)/Ai×100%，其中Ai為反應(yīng)初始吸收值，Af為反應(yīng)終止吸收值。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化還原介體對(duì)染料脫色的影響

相關(guān)研究表明，在反應(yīng)體系中添加一定的氧化還原介體可以提高漆酶對(duì)染料的脫色效率[11-12]。本研究首先探討了3種不同介體(ABTS、香蘭素、丁香酸)對(duì)染料脫色率的影響。室溫下進(jìn)行脫色反應(yīng)1 h后，測(cè)定吸光值，計(jì)算脫色率，結(jié)果如圖1所示。在不添加氧化還原介體的條件下，Trametessp. MA-X01漆酶對(duì)不同結(jié)構(gòu)染料均有一定的脫色能力，染料的脫色率為三苯甲烷類(lèi)>偶氮類(lèi)>雜環(huán)類(lèi)。與對(duì)照組相比，在反應(yīng)體系中添加不同介體對(duì)不同染料脫色率都有一定提高作用，其中添加ABTS效果最好，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用ABTS為反應(yīng)添加介體考察其他條件對(duì)漆酶脫色的影響。

圖1 不同介體對(duì)染料脫色的影響Fig.1 Effect of different redox mediators on the decolorization rate of different dyes

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)染料脫色的影響

不同反應(yīng)溫度對(duì)染料的脫色率的影響結(jié)果如圖2。將反應(yīng)體系分別置于20、30、40、50、60℃的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，反應(yīng)1 h后測(cè)定菌株Trametessp. MA-X01所產(chǎn)漆酶對(duì)不同染料脫色能力。隨著反應(yīng)溫度的升高，染料的脫色率有所提高，各種染料的在最高脫色率均出現(xiàn)在反應(yīng)溫度40℃的條件下。隨著溫度的進(jìn)一步升高，脫色率逐漸降低，其中伊文思藍(lán)、酸性鉻蘭K的脫色率降幅極為明顯，伊文思藍(lán)在60℃的脫色率僅為40℃的50%，酸性鉻蘭K在60℃的脫色率僅為40℃的35.94%。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)染料脫色率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the decolorization rate of different dyes

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)染料脫色的影響

如圖3所示，隨著溫育時(shí)間的延長(zhǎng)，各種染料的降解率逐漸提高。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Trametes sp. MA-X01所產(chǎn)漆酶對(duì)不同染料最大脫色速率發(fā)生在反應(yīng)的前3 h，3～12 h染料脫色率的增幅顯著降低。但對(duì)于不同的染料，脫色率的變化不同。例如亮綠SF 3 h脫色率達(dá)64.93%，12 h脫色率84.68%，24 h脫色率89.10%，即24 h脫色率比3 h脫色率增加約30%。而對(duì)于堿性紅2，3 h脫色率15.93%， 24 h脫色率30.77%，約增加1倍。因此，在應(yīng)用時(shí)可根據(jù)實(shí)際需要調(diào)整反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)，提高脫色效率，降低生產(chǎn)成本。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)染料脫色的影響Fig.3 Effect of reaction time on the decolorization rate of different dyes

2.4 給酶量對(duì)染料脫色的影響

不同給酶量(1 U、5 U)對(duì)染料脫色率的影響結(jié)果如圖4。實(shí)驗(yàn)表明，提高給酶量可以提高染料的脫色率。但對(duì)不同類(lèi)型的染料脫色率的影響差異較大。Trametessp. MA-X01漆酶對(duì)三苯甲烷類(lèi)染料(孔雀石綠和亮綠SF)的脫色效果最好，在給酶量為1 U的條件下，脫色率在80%左右，而在5 U的給酶條件下，脫色率均高于90%。即給酶量提高5倍，脫色率提高10%。對(duì)于兩種偶氮類(lèi)染料(伊文思藍(lán)和酸性鉻蘭K)，脫色效率中等，在給酶量由1 U提高到5 U，脫色率提高接近1倍。對(duì)于兩種雜環(huán)類(lèi)染料(酸性紅94和堿性紅2)，給酶量由1 U提高到5 U，染料脫色率分別提高51 %和40 %。

圖4 給酶量對(duì)漆酶脫色的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the decolorization rate of different dyes

2.5 染料濃度對(duì)染料脫色的影響

反應(yīng)液中染料濃度對(duì)脫色率的影響結(jié)果如圖5所示。對(duì)于脫色率較高的幾種染料，伊文思藍(lán)、孔雀石綠、亮綠SF，染料濃度對(duì)于脫色率幾乎沒(méi)有影響。而對(duì)于脫色率較低的幾種染料，隨著反應(yīng)液中染料濃度的增加，脫色率逐漸降低。反應(yīng)液中染料濃度由50 mg/L提高到200 mg/L，脫色率降低約30%。

圖5 染料濃度對(duì)脫色率的影響Fig.5 Effect of dye concentration on the decolorization rate of different dyes

3 結(jié)論與討論

漆酶在自然界中廣泛存在，具有較強(qiáng)的催化降解多種環(huán)境污染物的能力，但不同來(lái)源漆酶的酶學(xué)特性以及降解能力存在差異。本論文對(duì)白腐真菌Trametessp. MA-X01所產(chǎn)漆酶對(duì)3種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的6種染料的脫色能力進(jìn)行研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白腐真菌Trametessp. MA-X01所產(chǎn)漆酶對(duì)不同種類(lèi)的染料均有較好的脫色能力。在反應(yīng)液中添加氧化還原介體ABTS可以提高漆酶對(duì)染料的脫色作用，該酶在40℃的反應(yīng)條件下具有較好的催化效率，在反應(yīng)的前3 h具有較高的脫色速率，這些可能與該酶的最適反應(yīng)溫度以及酶穩(wěn)定性等酶學(xué)特性相關(guān)。另外脫色率的差異也與底物本身的結(jié)構(gòu)特征和化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，今后將進(jìn)一步探討Trametessp. MA-X01所產(chǎn)漆酶的特性，以及對(duì)不同底物的催化特異性，以期建立高效催化反應(yīng)體系，為該漆酶在染料脫色及環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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