賀望興 楊普香 石旭平 謝小群 朱運華 蔡翔

(江西省蠶桑茶葉研究所 330202)

草甘膦(C3H8NO5P)又稱農(nóng)達(Roundup)，是一種高效、低毒、廣譜和內(nèi)吸傳導(dǎo)、非選擇性葉面噴施的除草劑[1]。其主要存在形態(tài)為酸和以草甘膦異丙胺鹽為主的鹽類，微溶于水，不溶于一般有機溶劑，其異丙胺鹽完全溶解于水。草甘膦主要通過抑制植物體內(nèi)的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，從而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉(zhuǎn)化，使蛋白質(zhì)合成受到干擾，導(dǎo)致植物死亡[2]。自1971年Monsanto公司John Franz等開發(fā)以來，草甘膦以高效廣譜低毒而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物、林木和果園中，是全世界除草劑使用量最大的藥品[3]，然而草甘膦的大量使用對土壤、水體及生物等造成了較大的污染，同時對土壤生物化學(xué)過程產(chǎn)生一定影響，給環(huán)境尤其是土壤帶來污染和生態(tài)失衡，從而影響其在土壤中的生物轉(zhuǎn)化[4～5]。因此，草甘膦對人類和環(huán)境的毒性受到廣泛關(guān)注。

草甘膦在土壤中的降解是一個復(fù)雜的過程，降解的途徑和速率受到多種因素的影響[6]。據(jù)報道草甘膦在土壤中的半衰期在1～174d 的范圍內(nèi)變化，其主要的降解產(chǎn)物為氨甲基磷酸(AMPA)[7]，其中土壤生物對草甘膦在土壤中的降解做出了主要貢獻[8]。Araújo 等[9]采用土壤呼吸方法測定土壤微生物對草甘膦降解，研究結(jié)果表明土壤中草甘膦的降解主要是由微生物作用導(dǎo)致的。本研究從長期施用草甘膦的茶園土壤中經(jīng)過初篩、復(fù)篩篩選分離得到一株能以草甘膦為唯一碳源生長并且能夠降解草甘膦的菌株，通過該菌株16Sr DNA同源性分析，推斷該菌株為微球菌屬。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，酵母提取物5，磷酸氫二鉀1，葡萄糖1，pH值 7．0～7．2。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15，pH 值7.0～7.2。

基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基MSM(g/L)：磷酸氫二納1.5，磷酸二氫鉀1.5，硝酸四氫氮1，硫酸鎂0.2，氯化鈣0.01，硫酸鎂0.001，酵母提取物0.05，pH 值7.0～7.2。

分離培養(yǎng)基：在MSM培養(yǎng)基中加入草甘膦，使培養(yǎng)基中草甘膦的終濃度達到實驗所需濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試土壤的馴化

采用五點采樣法收集茶園草甘膦污染區(qū)土壤，然后將土壤按1:1:1:1:1的比例混合于實驗容器內(nèi)，每天澆灌適量草甘膦稀釋液，保持土壤濕潤，第一個月澆灌的草甘膦稀釋液濃度為50mg/L，每個月以50mg/L的濃度增幅依次遞增，澆灌馴化6個月，即為馴化土樣。

1.2.2 降解菌系的富集及降解菌株的分離、純化

富集培養(yǎng)：取馴化土樣5g到100mL含草甘膦50mg/L的富集培養(yǎng)基中，30℃，170r/min震蕩培養(yǎng)7d。

馴化培養(yǎng)：吸取富集培養(yǎng)液10mL轉(zhuǎn)接到100mL含有100mg/L的草甘膦的MSM培養(yǎng)基中，30℃，170r/min震蕩培養(yǎng)7d。取10mL培養(yǎng)液接入到濃度為200mg/L草甘膦的MSM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)方法同上，震蕩培養(yǎng)7d，用同樣的培養(yǎng)方法，以100mg/L的濃度增幅依次提高MSM培養(yǎng)基中草甘膦的濃度至1 000mg/L。

分離純化：將最終馴化得到的培養(yǎng)液經(jīng)過梯度稀釋后涂布在含有100mg/L草甘膦的MSM培養(yǎng)基平板上，每個梯度(10-1、10-2、10-3、10-4)涂布三塊平板，30℃恒溫培養(yǎng)3d。挑取生長旺盛的單菌落進行反復(fù)劃線純化，將純化后的菌株保存在含有15%甘油和100mg/L草甘膦的LB培養(yǎng)基中，編號，于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

將分離純化得到的降解菌采用平板劃線法接種到固體LB培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。

1.2.3.2 革蘭氏染色

通過革蘭氏染色法觀察對數(shù)生長期的降解菌個體形態(tài)及菌落特征，細菌鑒定則依據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行 。

1.2.4 CGL-1菌生長曲線分析

用接種環(huán)取一環(huán)經(jīng)過平板活化的CGL-1菌至含100 mg/L草甘膦的MSM液體培養(yǎng)基中，在30℃，170r/min的條件下每隔2 h取一次菌液，菌液在600nm[10]波長下測定其光密度值(OD)，繪制CGL-1菌的生長曲線。

1.2.5 菌株耐草甘膦最高濃度

將處于對數(shù)生長期的CGL-1菌適量分別接種到草甘膦梯度分別為200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L、1 200 mg/L、1 400 mg/L、1 600 mg/L、1 800 mg/L的MSM液體培養(yǎng)基中，每處理3個重復(fù)，以不加草甘膦的培養(yǎng)基作為對照，測定每個梯度濃度下CGL-1菌在30℃，170 r/min，培養(yǎng)1 d發(fā)酵液中CGL-1菌活性,確定CGL-1菌旺盛生長的最高耐草甘膦濃度。

1.2.6 CGL-1菌系統(tǒng)發(fā)育樹分析

1.2.6.1 菌株總DNA的提取

①取1mL菌液，8 000g，離心2min，棄上清，加400μL提取緩沖液沖洗細胞2次，8 000g，離心2 min，棄上清。

②用200μL TE buffer懸浮菌體，加入100μL的Tris 飽和酚(pH 值8.0)，渦旋混合1 min。

③13 000 g，離心5 min，取上清。

④加入40μL TE buffer和100μL氯仿，混合震蕩，13 000 g，離心5 min。

⑤取160μL上清液，加入40μL TE buffer和5μL RNase(10mg/mL)，37℃放置10 min。

1.2.6.2 菌株16S rDNA擴增

引物序列：

P0：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

P6：5’-CATCGGCTACCTTGTTACGA-3’

PCR擴增反應(yīng)體系：

反應(yīng)物 體積(μL)

細菌總DNA模板(約100ng/μL) 1

Taq PCR Mix 12.5μL(2x) 12.5

引物 P0(10μΜ) 1

引物 P6(10μΜ) 1

去離子水 9.5

PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物送往上海生工生物公司測序。

1.2.6.3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序結(jié)果序列提交GenBank進行BLAST比對，下載相似度大于95%的模式菌株的序列，以fasta格式整合到一個文件內(nèi)，啟動MEGA 5.0軟件，將得到的整合文件導(dǎo)入到MEGA軟件，序列全選，用Align by Clustal W進行多重序列比對，比對結(jié)束后，選擇菜單欄中Analysis選項中的 phylogeny Construct/Test Neighbor Joining Tree選項進行序列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，然后計算分枝間的遺傳距離。Boostrap值設(shè)置為1 000來分析分支系統(tǒng)發(fā)育樹各分支聚類的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與形態(tài)鑒定

經(jīng)過連續(xù)6個月的土壤菌株馴化培養(yǎng)，再通過平板劃線分離技術(shù)，得到一株以草甘膦為唯一碳源的菌株，將其命名為CGL-1，該菌株在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體呈球形，無莢膜和芽孢。在LB固體培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)基上呈黃色、表面光滑、微隆起、邊緣整齊的菌落。革蘭氏染色實驗鑒定結(jié)果顯示該菌為革蘭氏陽性菌。

2.2 菌株生長曲線

如圖1所示，CGL-1菌在液體搖瓶培養(yǎng)初期細菌由于主要在適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境以及為對數(shù)生長期的快速繁殖合成必要的前體物質(zhì)而生長緩慢，在2～14h培養(yǎng)時間內(nèi)菌株處于對數(shù)生長期，該期間CGL-1菌快速繁殖，菌濃度越來越高；培養(yǎng)14h之后由于培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡以及有害次生代謝產(chǎn)物的積累導(dǎo)致菌株生長量低于死亡量，細菌進入衰亡期。

2.3 菌株耐草甘膦最高濃度

如圖2所示，當(dāng)發(fā)酵液中草甘膦濃度在0～1200mg/L濃度范圍內(nèi)，30℃，170r/min，培養(yǎng)1 d，測定OD600值，結(jié)果各梯度濃度下CGL-1菌活性隨草甘膦濃度的增加而提高，草甘膦濃度為1 200 mg/L時菌活性最高；但當(dāng)草甘膦濃度大于1 200mg/L之后 CGL-1菌活性逐漸下降。實驗結(jié)果表明，CGL-1菌對草甘膦具有較好的耐受性，但草甘膦濃度過高會抑制CGL-1生長，CGL-1對草甘膦的最高耐受濃度為1 200 mg/L。

圖2 CGL-1菌耐草甘膦活性

2.4 細菌系統(tǒng)發(fā)育樹分析

如圖3所示，CGL-1與9株同源關(guān)系較近的模式菌株形成了2個不同的分支，表明這些菌株屬于2個不同的亞群，CGL-1與云南微球菌Micrococcusyunnanensis(KC514114)親緣關(guān)系最近，通過對CGL-1菌16S rRNA同源性分析以及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析進一步驗證了本實驗分離得到的降解草甘膦的菌株CGL-1為微球菌屬。

圖3 CGL-1菌系統(tǒng)進化樹

3 小結(jié)與討論

草甘膦的分解主要要靠土壤中的微生物對它的降解作用。自1983年Moore等分離到第一株降解草甘膦的假單胞菌菌株(Pseudomonassp.)后，陸續(xù)有多株降解微生物被分離。早期分離到的菌株大多以草甘膦為磷源，這些細菌菌株分屬于產(chǎn)黃菌屬(Flavobacteriurn) 、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、產(chǎn)堿桿菌屬 (Alcaligenes)及根瘤菌科(Rhizobiaceae)中[10～13]。近年來，從擬青霉(Paecilomycesvarioti)、克柔假絲酵母(Candidakruseis)、黑曲霉(Aspergilusniger)等真菌中也分離到了多株可降解草甘膦的菌株[14～17]。但有關(guān)微球菌屬草甘膦農(nóng)藥降解菌的報道還很少見到，本實驗從農(nóng)藥馴化土壤中分離篩選出一株潛在的降解草甘膦的菌株CGL-1，該菌株通過形態(tài)學(xué)，16S rDNA同源性分析以及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹等方法鑒定為微球菌屬。菌株CGL-1能在以草甘膦為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中生長良好，對草甘膦的最高耐受濃度為1 200mg/L，顯示對草甘膦具有較好的降解效能。后續(xù)CGL-1對草甘膦的降解效能以及田間試驗將是本研究的重點工作。CGL-1菌的分離豐富了草甘膦農(nóng)藥降解菌資源，在被污染的土壤和污水等環(huán)境的生物修復(fù)中具有很大的應(yīng)用潛力，同時應(yīng)該深入研究降解菌有關(guān)酶和基因，本人認為將降解草甘瞵的基因克隆后轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，使草甘膦在農(nóng)作物中快速催化代謝為無毒產(chǎn)物的研究是今后該領(lǐng)域的研究熱點。

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