單文娟,潘永勝

(1．江蘇宿城經濟開發(fā)區(qū)管理委員會，江蘇 宿城 223800； 2.宿遷市林木有害生物檢疫防治站，江蘇 宿遷 223800)

蠐螬即金龜子的幼蟲，是主要的地下害蟲之一，可危害多種農作物和花卉苗木的種子、根及幼苗等，而影等鰓金龜的幼蟲個體相對較大，危害更重。蠐螬的常規(guī)防治方法有藥物拌土、毒餌誘殺等，但長期、大量化學藥劑的使用，使害蟲產生一定的抗藥性，更主要的是會造成土壤、水體等環(huán)境的污染，而真菌殺蟲劑具有使用安全、不污染環(huán)境、可擴散流行和害蟲不易產生抗性等優(yōu)點，是國內外生物防治的研究重點。陳斌等室內測定了從棕色金龜子幼蟲體上分離的金龜子綠僵菌對小云斑鰓金龜幼蟲的毒力，趙文琴等應用不同的綠僵菌、白僵菌菌株對銅綠麗金龜的幼蟲進行了生物測定，結果顯示供試綠僵菌對靶標金龜子均有較強的毒性[1-2]，綠僵菌在其他多種農林害蟲的生物防治中也都取得了明顯成效。另外，最常用的綠僵菌菌劑為分生孢子，在生產、加工、儲存、運輸、使用等過程，可能會遇到短暫或持續(xù)高溫，一定程度上影響孢子萌發(fā)和致死力，研究分生孢子的耐高溫性，對于指導生產中的溫度控制，以及選擇適宜防治區(qū)域和防治時間等具有重要意義。本文選用幾株產孢量高的綠僵菌菌株，測定了其對影等鰓金龜幼蟲的毒力和耐高溫性，為以后的生物防治特別是利用綠僵菌等微生物防治害蟲提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)Ma785，Ma788，Ma789，Ma793，Ma795，Ma798，Ma799，Ma800，Ma801，Ma802，Ma804，Ma805，Ma806，Ma807，Ma808，Ma809，Ma811，Ma812，由中國林業(yè)科學研究院提供；Ma20，Ma42由安徽農業(yè)大學提供。

1.2 供試昆蟲

影等鰓金龜(Exolonthaumbraculata)幼蟲：采于江蘇省林業(yè)科學研究院天敵繁育場樓下東側空地，室溫下用馬鈴薯切塊單只單瓶飼養(yǎng)，待收集到一定數量后，挑選大小一致且健康的蟲體進行毒力測定。

1.3 菌株產孢量測定

采用點接法用接種針挑取綠僵菌孢子于PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂18 g/L)平板中央，放入(25±1) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復3次。菌株產孢量測定于菌落生長15 d后，用打孔器在菌落核心至邊緣1/2處取菌塊，置于裝有適量無菌水的錐形瓶中，使用渦旋式攪拌器充分振蕩直至均勻，血球計數板計數，換算成單位面積產孢量[3]。

1.4 室內毒力測定

將菌株產孢量測定中篩選出的產孢量高的3菌株的分生孢子粉分別用無菌水制成濃度為1.0×108個/mL的孢子懸浮液，用無菌水作對照，每個處理設重復3個，每個重復試蟲10頭[4]。用注射器注噴綠僵菌分生孢子懸浮液在幼蟲體表，每只注噴2 mL，對照注噴無菌水。處理后的試蟲置于廣口瓶中的濕土內，每瓶1頭蟲，用馬鈴薯切片飼喂，溫度控制在25—28 ℃，注意保持土壤的濕度，定期記錄感染蟲數。

1.5 分生孢子耐熱性測定

將篩選出的產孢量高的3菌株在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)14 d,在超凈工作臺上用接種鏟取綠僵菌孢子，放于裝有無菌水的三角瓶中，濃度約為106個/mL，用渦旋式攪拌器充分振蕩，然后分別放于溫度系列為25，30，35，40 ℃的水浴鍋中加熱12 h。用無菌毛刷蘸取滅菌過的PDA培養(yǎng)基均勻涂布于無菌載玻片上成一薄層，然后用無菌移液管取不同溫度水浴處理過的孢子懸浮液于載玻片的培養(yǎng)基薄層上，再用涂布棒涂布均勻，置于(25±1) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，統計萌發(fā)率。試驗設重復3個，每個重復各統計100個以上的孢子[5-6]。

2 結果與分析

2.1 綠僵菌的產孢量

20株綠僵菌PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)后的產孢量情況見表1。從表1中可見，產孢量最高的菌株是Ma789，其次是Ma788，Ma42。3菌株產孢量顯著高于其他菌株。因利用綠僵菌開展生物防治中最常用的菌劑形式為分生孢子，故本文選用此3菌株作進一步的毒力和耐高溫性測定。

表1 20株綠僵菌的產孢量(以菌株編號排序)

2.2 對影等鰓金龜幼蟲的毒力

感染的影等鰓金龜幼蟲初期行動遲緩，身體呈萎靡狀態(tài)，然后體表出現淺褐色斑點，隨著感染的不斷發(fā)展，蟲體全身變成深褐色，不久便死亡。死亡不久被感染蟲體開始變硬并長出白色絮狀菌絲，后菌絲布滿全身且變綠。從感染率可看出，3菌株對影等鰓金龜幼蟲的毒力強弱依次為Ma789>Ma788>Ma42，具體結果見表2。

表2 綠僵菌對影等鰓金龜幼蟲的毒力

2.3 不同溫度處理后分生孢子萌發(fā)率

3菌株經25，30，35，40 ℃不同溫度水浴處理后，孢子萌發(fā)率見圖1，在25 ℃和30 ℃水浴處理后的3菌株孢子萌發(fā)力差別不大，表現出高萌發(fā)率，均在96%以上；經35 ℃水浴處理后，Ma42萌發(fā)率下降為82.367%，Ma788，Ma789萌發(fā)率分別為72.939%和71.269%；而經40 ℃水浴處理后，3菌株孢子萌發(fā)率顯著下降到35%以下，其中Ma788表現較強的耐熱性，Ma42耐熱性適中，Ma789孢子萌發(fā)率卻下降到了16.809%。

圖1 不同溫度處理后各菌株孢子萌發(fā)率

3 結論

20株綠僵菌于PDA平板培養(yǎng)15 d后，通過對其產孢量計量可知，產孢量最高的為Ma789，達到133.955×108個/mm2，產孢量最低的是Ma795，僅有3.647×108個/mm2。選用其中產孢量高的Ma42，Ma788，Ma7893菌株對影等鰓金龜幼蟲進行了室內毒力和耐高溫性測定，由于影等鰓金龜幼蟲個體相對較大，抵抗力較強，故試驗結果沒有預期理想，但從感染率可知，3菌株中毒力最強的是Ma789，其次是Ma788，再次是Ma42；經不同溫度水浴處理后的孢子萌發(fā)率情況表明，3菌株中耐高溫較強的是Ma788，其次是Ma42，而Ma789耐高溫性相對較差?？梢姡疚闹泄┰囼灥?菌株毒力和耐高溫性未表現一定的相關性，因為綠僵菌最常用的菌劑形式為分生孢子。本文僅選擇了產孢量高的3菌株進行了進一步的毒力及耐高溫性測定，不排除其他17株綠僵菌對影等鰓金龜毒力更強的可能性。另外，Ma789的野外毒力情況及其孢子在土壤中的宿存能力等，都有待以后的進一步研究。

參考文獻：

[1] 陳 斌,李正躍,杜富榮,等.金龜子綠僵菌對馬鈴薯田小云斑鰓金龜子的生物防治潛力評價[J].云南農業(yè)科技,2003(b12):147-150．

[2] 趙文琴,樊美珍,蔡守平,等.不同綠僵菌、白僵菌菌株對銅綠麗金龜幼蟲的毒力生物測定[J].生物學雜志,2005,22(5):43-45．

[3] 李寶玉,張禮生,農向群,等.金龜子綠僵菌孢子低溫休眠與復蘇[J].中國生物防治學報,2005,21(3):198-200．

[4] 潘永勝,徐福元,韓正敏.楊扇舟蛾幼蟲高毒力綠僵菌菌株篩選研究[J].江蘇林業(yè)科技,2012,39(5):13-15,44．

[5] 潘永勝,徐福元,韓正敏,等.松褐天牛成蟲高毒力綠僵菌菌株篩選及液體振蕩培養(yǎng)條件[J].林業(yè)科學研究,2010,23(1):102-107．

[6] 宋 漳,徐樂勤,江 濤.8株綠僵菌孢子萌發(fā)條件及室內侵染馬尾松毛蟲試驗[J].浙江農林大學學報,1997,14(2):165-168．