曾麗瓊，何學(xué)友，蔡守平，黃金水

(福建省林業(yè)科學(xué)研究院/國(guó)家林業(yè)局南方山地用材林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350012)

松萎蔫病又名松材線蟲病，是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引發(fā)的一種森林病害，屬國(guó)際重要檢疫對(duì)象，列為森林病蟲害之首[1]，被稱為“松樹的癌癥”[2-3]。該病靠媒介松墨天牛(Monochamusalternatus)攜帶傳播，使用化學(xué)藥劑可以有效控制松褐天牛，但化學(xué)藥劑造成的環(huán)境污染對(duì)生態(tài)平衡帶來越來越明顯的負(fù)面影響。隨著人們環(huán)境意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)植物寄生線蟲生物防治細(xì)菌的研究逐漸興起，應(yīng)用細(xì)菌防治植物寄生線蟲的工作己經(jīng)取得了諸多進(jìn)展。研究人員對(duì)于利用細(xì)菌作為松材線蟲防治制劑的報(bào)道，多見于對(duì)具有殺松材線蟲活性細(xì)菌的篩選，如牛秋紅、鄭海營(yíng)等[4-5]分別從土壤和海水中分離篩選出對(duì)松材線蟲具有較強(qiáng)殺線蟲活性的細(xì)菌。內(nèi)生細(xì)菌作為最具防病潛力與應(yīng)用價(jià)值的一類生物防治細(xì)菌，是植物病害生物防治的天然資源菌，其廣闊的理論研究?jī)r(jià)值和開發(fā)應(yīng)用前景，成為許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)對(duì)象[6-8]。馬尾松作為松材線蟲的寄主，從其本身分離篩選對(duì)松材線蟲活性有抑制作用的細(xì)菌，是理性控制松材線蟲病的途徑，但是對(duì)于從松樹上分離的內(nèi)生細(xì)菌的研究報(bào)道較少，僅見朱麗梅、鄧海娟、李亮亮等[9-11]的報(bào)道。本研究開展了對(duì)馬尾松內(nèi)生細(xì)菌分離和對(duì)松材線蟲殺線活性的測(cè)定研究，篩選出具有較強(qiáng)抑制線蟲活性的細(xì)菌，并對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行初步鑒定，以期為微生物防治和開發(fā)植物寄生線蟲生物防治制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2014年11月，2015年3，6和9月分別選取在松材線蟲疫區(qū)健康生長(zhǎng)的馬尾松枝條作為分離材料的來源。樹齡為6—7年生，采樣時(shí)將枝條放入滅菌的紙袋中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離。松材線蟲來源于疫區(qū)枯死木，采用貝曼漏斗法分離后在多毛孢平板中培養(yǎng)備用。

1.2 內(nèi)生菌分離

取松樹嫩梢松針、枝條，依次用無(wú)菌水沖洗表面，75%乙醇消毒30 s、10%NaClO消毒5 min，再在無(wú)菌水中漂洗4次，用消毒枝剪剪成小段，放入裝有2 mL無(wú)菌水和少許滅過菌的石英砂的無(wú)菌研缽，將其研磨成勻漿后，靜置5 min。用移液槍吸取150 μL于NA平板中涂板，28 ℃下培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后，觀察生長(zhǎng)細(xì)菌菌落的狀況。同時(shí)檢查檢驗(yàn)表面消毒的效果，方法為吸取150 μL第4次漂洗消毒材料的無(wú)菌水，涂平板，經(jīng)培養(yǎng)后若無(wú)微生物長(zhǎng)出，證明表面消毒徹底。3—7 d，待長(zhǎng)出菌落后，對(duì)不同單菌落的顏色、大小、突起特征、邊緣特征、表面光滑與否和透明度等的特征進(jìn)行描述，并根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色和大小選取分離到的菌株，在平板上進(jìn)行純化保存。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌殺線蟲活性測(cè)定

將保存的菌株在NA平板上活化后接種到NA培養(yǎng)液中，28 ℃條件下160 r/min培養(yǎng)48 h，取2 mL細(xì)菌發(fā)酵液至離心管中，經(jīng) 5 000 r/min離心5 min，取上清液，用濾膜孔徑為0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾，取900 μL濾液分裝到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的樣品孔中，以不接菌的NA培養(yǎng)液濾液為對(duì)照，加入線蟲懸液100 μL(50 000 條/mL)混勻，每個(gè)處理重復(fù)3次，25 ℃下慢速振蕩培養(yǎng)，分別在處理24和48 h后觀察并統(tǒng)計(jì)線蟲死亡數(shù)，觀察時(shí)取100 μL(觀察的線蟲總數(shù)不少于30頭)點(diǎn)到載玻片上，在10倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)死亡線蟲數(shù)及線蟲總數(shù)(線蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)是蟲體僵直，用解剖針攪動(dòng)或接觸刺激時(shí)仍不活動(dòng)視為死亡[12-13])。毒力級(jí)別劃分參照萬(wàn)樹青[14]方法，即Ⅰ級(jí)：死亡率≥90%；Ⅱ級(jí)：70%≤死亡率<90%；Ⅲ級(jí)：50%≤死亡率<70%；Ⅳ級(jí)：30≤死亡率<50%；Ⅴ級(jí)：10≤死亡率<30%；Ⅵ代表無(wú)殺線活性。

1.4 高活性菌株的鑒定

對(duì)得到的高活性菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，革蘭氏染色和KOH拉絲試驗(yàn)按照常規(guī)方法進(jìn)行。細(xì)菌基因組的提取利用PCR技術(shù)，對(duì)待鑒定細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，其中正向引物27F：5’-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3’，反向引物1492R：5’- T￣A￣C￣G￣G￣C￣T￣A C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C G￣A￣C￣T￣T-3’。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)33次，再在72 ℃延伸5 min后終止反應(yīng)。 PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖膠電泳進(jìn)行分析，緩沖液為TAE，委托福建省尚辰生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI上面進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選取同源性高的菌株模式菌株序列，用MEGA5.0的Neighbor—Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值取1 000。

表1 6株細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)松材線蟲的殺線蟲活性比較

2 結(jié)果和分析

2.1 具殺線蟲活性內(nèi)生細(xì)菌分離及篩選

經(jīng)分離得105株馬尾松內(nèi)生細(xì)菌，篩選到6株能夠比較有效的抑制松材線蟲活性。由表1中可知，具有殺線蟲活性的細(xì)菌發(fā)酵濾液處理松材線蟲24 h后，死亡率在50%及以上，活性級(jí)別均不低于Ⅲ級(jí)，并且使線蟲蟲體滲漏或消解。6株細(xì)菌的殺線活性存在明顯差異，細(xì)菌Z11-2培養(yǎng)濾液處理松材線蟲24 h的致死率達(dá)到92%，與其他5株存在極顯著差異，Z35-1和G36處理也超過85%；6株細(xì)菌對(duì)松材線蟲的消解率也存在差異極顯著，其中Z11-2培養(yǎng)濾液的消解水平最高，48 h后松材線蟲蟲體消解率為87.4%，其次為G36菌株，其消解率為77.5%，Z35-1培養(yǎng)濾液對(duì)松材線蟲的消解率也超過了70%，說明這3株細(xì)菌培養(yǎng)液中含有較高的殺線蟲活性物質(zhì)，并可能含分解松材線蟲體壁的物質(zhì)。

2.2 具較高殺線蟲活性內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

由表2可知，細(xì)菌Z11-2和G36菌體桿狀，有芽孢形成，為革蘭氏陽(yáng)性。Z11-2形成乳白色稍有光澤的圓形半透明菌落，菌落表面光滑稍有凸起，邊緣整齊；細(xì)菌G36菌落白色不透明，表面濕潤(rùn)光滑稍有凸起，邊緣整齊。通過PCR技術(shù)，分別得到2株細(xì)菌16S rDNA的特異性擴(kuò)增，將序列分別與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2株細(xì)菌與芽孢桿菌屬的同源性都較高：菌株Z11-2與Bacilluspumilus的最大相似性達(dá)到100%，菌株G36與B.pumilus的同源性為99%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，選取芽孢桿菌屬20種的模式菌株序列與細(xì)菌Z11-2和G36的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)，Z11-2和G36與B.pumilus(AY876289.1)位于同一簇群，親緣關(guān)系最近，初步鑒定其為短小芽孢桿菌。

表2 2株具較高殺線活性細(xì)菌形態(tài)特征

圖1 細(xì)菌Z11-2和G36的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2 結(jié)論與討論

在馬尾松上分離得到6株對(duì)松材線蟲活性具有抑制作用的細(xì)菌Z11-1，Z11-2，Z35-1，G31，G36，G42，其中細(xì)菌Z11-2和G36的殺線活性較強(qiáng)，其毒力級(jí)別在Ⅱ級(jí)以內(nèi)，處理24 h的松材線蟲死亡率分別為92%和89%，48 h線蟲消解率分別為87.4%和77.5%。通過形態(tài)特征觀察，結(jié)合16S rDNA序列分析，初步鑒定這2株細(xì)菌為短小芽孢桿菌(B.pumilus)。

具殺線活性的微生物及其代謝產(chǎn)物為數(shù)不少，但目前能夠商品化的微生物制劑為數(shù)極少，植物寄生線蟲生物防治細(xì)菌的研究是控制線蟲危害的一種重要防治途徑。據(jù)有關(guān)報(bào)道，至今已發(fā)現(xiàn)多種對(duì)松材線蟲具有殺線蟲活性的細(xì)菌，如徐華潮等[15]發(fā)現(xiàn)一些蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)的伴孢晶體蛋白對(duì)松材線蟲有明顯毒殺作用，Oliveira等[16]曾報(bào)道側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporu)對(duì)松材線蟲具有殺線蟲活性，郝穎[17]在腌制芥菜表面分離篩選得到1株具有殺松材線蟲活性的蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)LZ-01，朱麗梅、李亮亮等[9-11]從松樹體內(nèi)分離篩選出對(duì)松材線蟲具有較高殺線蟲活性的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciensJK-JS3)和短小芽孢桿菌(B.pumilusLYMC-3)。篩選有效的拮抗細(xì)菌，對(duì)于開發(fā)新的植物寄生線蟲生物防治細(xì)菌制劑有重要意義，但現(xiàn)在對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的研究報(bào)道，只是分離、純化、種類鑒定、離體防治效果及室內(nèi)防治效果測(cè)定，因林間防治效果受到多種復(fù)雜因素的影響，離體防治效果和室內(nèi)防治效果的結(jié)果一般不能反映林間防治效果[18]。本試驗(yàn)將繼續(xù)開展內(nèi)生細(xì)菌用于線蟲的林間防治試驗(yàn)，這對(duì)于保護(hù)森林資源，尤其是一些受松材線蟲病威脅的風(fēng)景名勝區(qū)、重點(diǎn)生態(tài)區(qū)的安全有重要意義。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌Z11-2和G36培養(yǎng)濾液不但使松材線蟲死亡，還能造成線蟲體壁被分解，引起線蟲內(nèi)容物的泄漏，最終使線蟲蟲體的消解，這與前人研究報(bào)道[9-10,19]基本相同。試驗(yàn)篩選出的細(xì)菌發(fā)酵濾液之所以對(duì)松材線蟲有較高殺線活性，可能是產(chǎn)生了某種對(duì)松材線蟲活性有抑制作用的物質(zhì)，但該類物質(zhì)的性質(zhì)及其作用途徑等尚不明確，不同菌株產(chǎn)生的物質(zhì)是否相同也有待研究。

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