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        胃癌患者腫瘤組織與外周血T細胞受體CDR3的差異分析

        2018-05-24 01:26:16丁順凱林烈文林小聰鐘克力
        關(guān)鍵詞:外周血克隆測序

        朱 瑩,丁順凱,林烈文,劉 松,林小聰,鐘克力,戴 勇,潘 凱

        (暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,深圳市人民醫(yī)院:1臨床醫(yī)學(xué)研究中心,2胃腸外科,廣東深圳518020)

        0 引言

        胃癌(gastric cancer,GC)是消化道常見的惡性腫瘤之一,由于早期癥狀多缺乏特異性,早期病例僅占胃癌手術(shù)病例的10%~20%,大約三分之二的患者在確診時已經(jīng)處于中晚期或已出現(xiàn)淋巴結(jié)、血行轉(zhuǎn)移,其五年生存率僅為20%~30%[1-2]。 胃癌的發(fā)病、進展及侵襲機制涉及多種免疫、遺傳、分子機制及細胞生物等因素,研究胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子調(diào)控機制,尋找新的生物學(xué)靶標(biāo)對胃癌的診斷、治療、預(yù)后及開展個體化治療等都具有重要意義。

        免疫組庫(immune repertoire,IR)是指在任何指定時間,某個個體的循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B細胞或者T細胞的多態(tài)性總和。研究[3-4]表明,腫瘤患者局部或者全身處于免疫抑制或者免疫缺陷狀態(tài),是腫瘤發(fā)揮免疫逃逸的關(guān)鍵因素之一。腫瘤浸潤淋巴細胞(tumour?infiltrating lymphocytes, TIL) 作為機體局部免疫狀態(tài)的標(biāo)志,在腫瘤免疫中起著重要的作用,TIL與腫瘤預(yù)后的關(guān)系在多種腫瘤中都已經(jīng)得到證實[5-6]。早期的研究技術(shù)可以鑒別 TIL中T細胞類型,在群體水平闡明效應(yīng)、輔助及調(diào)節(jié)性T細胞與臨床結(jié)果的關(guān)系。但只有極少量的數(shù)據(jù)研究了TIL種群在空間上是否局限于腫瘤微環(huán)境,并區(qū)分于循環(huán)T細胞庫。近年來,采用高通量測序技術(shù)研究個體免疫細胞的多態(tài)性已成為腫瘤免疫學(xué)研究的熱點[7-9]。借助于免疫組庫高通量測序技術(shù),直接對腫瘤組織中所有的 T細胞抗原受體(T?cell receptor,TCR)基因進行深度序列測定,可以了解腫瘤內(nèi)TCR的克隆性變化,從整體上研究 TIL 的特性[10-13]。

        本研究采用二代測序技術(shù),采集胃癌患者的腫瘤組織、癌旁組織及外周血,提取DNA,經(jīng)多重PCR,對TCR β鏈的CDR3區(qū)進行建庫,采用 Illumina HiSeq 2000系統(tǒng)測序,分析比較胃癌患者不同類型組織TCR CDR3組庫的組成特征。

        1 材料和方法

        1.1 一般資料 原發(fā)性胃腺癌病例來源于深圳市人民醫(yī)院,收集胃癌患者經(jīng)手術(shù)切除的腫瘤組織及癌旁組織,胃癌診斷經(jīng)由組織病理學(xué)檢查確認,同時在術(shù)前采集患者外周血。7例胃癌病例中,4例男性,3例女性,年齡 26~85 歲,平均年齡(62.4±21.9)歲。

        1.2 DNA提取及PCR建庫 血液及組織DNA提取采用Qiagen DNA提取試劑盒,使用Qubit fluorome?ter測定DNA濃度。取500 ng基因組DNA作為模板,采用特異的V區(qū)引物和J區(qū)引物,用QIAGEN Multiplex PCR Kit進行多重PCR。電泳檢測并使用QIAquick Gel Extraction kit膠回收100~190 bp的多重PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物中加入End Repair Mix,進行末端修復(fù)反應(yīng),并用QIAquick PCR Purification Kit進行純化。經(jīng)過末端修復(fù)后的DNA片段在其3'端連上“A”堿基,再用 Adapter oligo mix和 DNA ligase進行接頭連接,在DNA片斷上接上接頭(adapter)。通過PCR反應(yīng)富集經(jīng)過接頭修飾的DNA片段,PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,膠回收(QIAquick Gel Extraction kit)目的片段,完成文庫構(gòu)建。

        1.3 文庫檢測及測序 使用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent DNA 1000 Reagents)檢測文庫的插入片段范圍;并使用 ABI StepOnePlus Real?Time PCR System(TaqMan Probe)對文庫進行濃度的定量。

        將檢測合格的文庫加入NaOH變性成單鏈,并稀釋,加入到FlowCell內(nèi),與FlowCell上的接頭雜交,然后在簇生成平臺cBot上完成橋式PCR擴增。最后將制備好的FlowCell采用Illumina HiSeq 2000測序系統(tǒng)測序。

        1.4 數(shù)據(jù)分析 原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾、拼接得到合并序列,用miTCR軟件自動校正序列錯誤。比對完成后,統(tǒng)計TCRβ鏈CDR3克隆的表達及插入缺失情況,并統(tǒng)計CDR3序列的長度分布。

        根據(jù)比對分析得到的結(jié)果,統(tǒng)計每一個克隆的表達情況,分別統(tǒng)計DNA序列、氨基酸序列、V?J組合的表達情況。采用方差分析評價三組樣品的VJ基因取用及氨基酸取用差異。同時統(tǒng)計每一個樣品中每個克隆的表達情況,進行樣品多樣性差異分析和克隆表達差異分析。

        2 結(jié)果

        2.1 測序數(shù)據(jù)匯總 統(tǒng)計腫瘤組織(TIL組)、癌旁組織(adjacent normal tissues, ADJ)、外周血(periph?eral blood mononuclear cell,PBMC)三組標(biāo)本的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出情況,其中,ADJ獲得的克隆數(shù)為(41 188±29 417)、PBMC 組的克隆數(shù)為(32 184±16 054),TIL 組則為(36 038±18 999)??梢钥闯觯┡越M樣品的平均克隆類型最高,其次是腫瘤組,最少的是外周血(無顯著差異)。

        2.2 VJ基因取用差異分析 通過統(tǒng)計分析在每個分組里面有不少于3個樣品有表達的VJ基因,采用方差分析(Aov)比較了 TIL、ADJ、PBMC三組的 VJ基因取用差異,得到了23種具有顯著差異(P<0.05)的VJ基因(表 1)。

        2.3 CDR3的氨基酸(aa)差異分析 根據(jù)測序得到的CDR3區(qū)氨基酸序列,將每個樣品的總克隆型(total clonotype)均一到1M總量,此外,至少有一個分組里面有3個樣品有表達的克隆型才會用于檢驗。統(tǒng)計得到TIL、ADJ、PBMC3組標(biāo)本的CDR3的氨基酸差異取用情況。其中41種氨基酸序列具有顯著差異(P<0.05,表 2)。

        表1 三組樣品間23種差異取用的VJ基因

        2.4 組間差異及高表達克?。╤yper express clono?type,HEC)分析 每個樣品中表達比例高于1%的克隆型被認為是超高表達的克隆,用方差分析及成對T檢驗統(tǒng)計分析三組樣品的總克隆型(total clono?type)、單一克隆型(uniq clonotype)、高表達克隆、D50等數(shù)據(jù)。統(tǒng)計結(jié)果顯示,除了外周血與腫瘤組織的香儂多態(tài)性差異顯著(P=0.029)之外,三組之間的統(tǒng)計值無顯著差異(P>0.05),表明胃癌患者不同組織間的TCR克隆多態(tài)性及分布頻率差異不明顯。

        2.5 組間共有克?。╯hared clonotype)分析 將每個樣品的克隆型總表達量歸一到1 M,其中平均表達量不小于1的克隆型視為高質(zhì)量的克隆型,統(tǒng)計分析三組樣品中共有的總克隆型(圖1)及高質(zhì)量克隆型(圖2)。圖1可見,ADJ的總克隆型種類數(shù)最高,TIL其次。與圖1比較,圖2中顯示癌旁組的高質(zhì)量的克隆型并未明顯增多,表明癌旁組克隆型多數(shù)為低表達,此外,在組間共有的高質(zhì)量克隆型種類上,癌旁組織與腫瘤組織(12 842)明顯多于癌旁組織與外周血(1211)及腫瘤組織與外周血(1925)。

        表2 三組樣品間41種差異取用的氨基酸序列

        圖1 TIL、ADJ、PBMC中共有的總克隆型分布

        圖2 TIL、ADJ、PBMC中共有的高質(zhì)量克隆型分布

        3 討論

        胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,其分子機制的研究及靶向藥物的開發(fā)對于早期診斷、治療及預(yù)后具有重要意義。腫瘤浸潤淋巴細胞作為重要的抗腫瘤免疫細胞,能夠直接反映腫瘤微環(huán)境中的免疫狀態(tài),并與腫瘤預(yù)后相關(guān)[5-6]。 其中,T淋巴細胞是參與特異性免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細胞,其細胞表面的抗原受體是由2條多肽鏈αβ或γδ通過二硫鍵連接而成的異二聚體,其中αβ T細胞占絕大多數(shù)。在個體發(fā)育過程中,TCR β鏈的V、D、J基因片段發(fā)生重排,形成具有高度多樣性的可變區(qū)——互補決定區(qū)3(complementarity?determining region, CDR3),其序列決定了一個獨特的TCR克隆型,因此可通過檢驗CDR3的長度或序列來判斷T細胞的克隆性。

        Luo等[14]分析了不同分化程度的胃腸道腫瘤患者外周血中CD4+/CD8+T細胞亞群的CDR3譜型,發(fā)現(xiàn)復(fù)雜性積分(the complexity scores,反映TCR庫的多樣性)與腫瘤組織分化程度顯著相關(guān)。此外,研究[15]證實預(yù)后較差的胃癌患者外周血中往往能發(fā)現(xiàn)特異性的T細胞沒有被充分的誘導(dǎo)或者作用被抑制。近年來,采用高通量測序技術(shù)直接針對腎癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌等腫瘤組織中TIL的克隆特性的研究也有報道[10-13]。 在胃癌的研究上,Jia等[16]研究了28例胃癌病例的腫瘤組織、正常粘膜及外周血中T細胞的多樣性,發(fā)現(xiàn)CDR3的氨基酸克隆型分布在不同組織中無顯著差異。Kuang等[17]則檢測了19例不同階段胃癌患者的41個組織樣品,發(fā)現(xiàn)T細胞克隆的多樣性及分布頻率在胃癌發(fā)展過程中沒有變化。但胃損傷及相鄰組織T細胞克隆的重疊隨腫瘤發(fā)生過程降低。

        本研究對7例胃癌病例的腫瘤組織、癌旁組織、外周血共20個樣品分別進行了TCR β鏈CDR3區(qū)測序,獲得了一些差異性取用的VJ基因序列及氨基酸序列。而CDR3全部克隆型、單一克隆型、高表達克隆的分布在不同組織間沒有顯著差異。在三組樣品的總克隆型及高質(zhì)量克隆型的重疊情況上,癌旁組織的總克隆型種類數(shù)最高,腫瘤組織其次,推測腫瘤組織內(nèi) TIL可能受到腫瘤相關(guān)抗原(tumor?associated antigen,TAA)的影響,其CDR3庫呈現(xiàn)限制性表達的特點。此外,癌旁組織的TIL克隆型多數(shù)為低表達,癌旁組織與腫瘤組織的高質(zhì)量的共有克隆型明顯多于外周血,提示腫瘤組織T細胞向癌旁組織滲透的可能,即這些差異克隆型可能參與了胃癌細胞的遷徙及擴散過程,其具體作用機制仍需進一步研究。

        由于個體免疫系統(tǒng)存在龐大的復(fù)雜性及個體差異性,不同組織樣品間同樣存在異質(zhì)性,TIL TCR克隆型的表達豐度及克隆型種類水平上的差異均可能受到影響。Jia等[16]指出,胃癌患者的TIL庫及 PB?MC庫均不代表抗腫瘤反應(yīng)的總體質(zhì)量,因此不能預(yù)測疾病結(jié)果,而腫瘤鄰近粘膜組織TCR庫的多樣性指數(shù)(diversity index)則是胃癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。同樣的,本研究結(jié)果顯示,雖然不同類型組織樣品的克隆分布特性沒有顯著差異,癌旁組織的總克隆型在三種組織中種類數(shù)最高,多為低表達克隆型,提示癌旁組織的T細胞可能受到腫瘤組織及循環(huán)血液的共同影響,多樣性更高。為了消除個體差異及病例數(shù)的影響,仍需要進一步研究癌旁組織的TCR克隆型特征,以明確胃癌腫瘤微環(huán)境的特性,對胃癌特異性抗原的鑒定可能具有重要意義。

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