趙宏鑫，王俊峰，3，4*

(1.中國(guó)科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 強(qiáng)磁場(chǎng)科學(xué)中心,安徽 合肥 230031；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽 合肥 230036;3.中國(guó)科學(xué)院 強(qiáng)磁場(chǎng)與離子束物理生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 安徽 合肥 230031； 4.安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院, 安徽 合肥 230601)

磁小體形成于趨磁細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，多數(shù)為單磁疇納米級(jí)晶體鐵磁顆粒Fe3O4，少數(shù)為Fe3S4所組成[1].由于磁小體在趨磁細(xì)菌體內(nèi)成鏈狀排列從而賦予趨磁細(xì)菌一定的磁偶極距[2]，使得趨磁細(xì)菌能夠響應(yīng)磁場(chǎng)，沿著地磁場(chǎng)或外加磁場(chǎng)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)[3-4].此外，磁小體顆粒由一層生物膜包裹，可防止磁性顆粒的集聚.與化學(xué)合成的磁性納米顆粒相比，磁小體不但具有低毒性的特點(diǎn)，還具有更好的生物兼容性[5-6].正因?yàn)榇判◇w具有這種天然的物理磁性以及生物特性，使得磁小體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用.Himmelreich等[7]成功地將磁小體顆粒轉(zhuǎn)入體內(nèi)并利用其制作成了造影劑；Xiang及更多的研究學(xué)者[6, 8-9]利用磁小體表面含有的多種活性基團(tuán)，用化學(xué)交聯(lián)劑把包括抗體、小分子藥物、酶、DNA分子等在內(nèi)的生物活性物質(zhì)修飾到磁小體顆粒上，用于免疫學(xué)檢測(cè)、腫瘤治療、細(xì)胞分離、疾病相關(guān)單核苷酸多態(tài)性分析及mRNA分析等研究；Alphandery等[8-9]則把磁小體轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞內(nèi)，利用交變磁場(chǎng)使磁小體放熱，使得局部溫度升高從而殺死腫瘤細(xì)胞.

CdTe/CdS 量子點(diǎn)(QDs)因其具有極高的量子效率和粒子大小可調(diào)的光學(xué)性質(zhì)而成為一種備受關(guān)注的近紅外(NIR)成像探針，相比傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料，具有許多優(yōu)異的光學(xué)性能，如激發(fā)波長(zhǎng)范圍寬、發(fā)射波長(zhǎng)范圍窄且對(duì)稱(chēng)、壽命長(zhǎng)、光學(xué)性能穩(wěn)定等，尤其由于近紅外光在組織內(nèi)具有很強(qiáng)的穿透能力，使得該探針可用于深層組織的成像[10-11].

筆者擬利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將CdTe/CdS量子點(diǎn)共價(jià)修飾到磁小磁上，研制出磁光載體，使載體兼具磁小體的磁性和量子點(diǎn)的發(fā)光性雙重特性，并將磁光載體轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞內(nèi)，初步實(shí)現(xiàn)磁光載體的細(xì)胞示蹤.此項(xiàng)研究將為后續(xù)的磁靶向給藥，磁靶向熱療及光示蹤一體化的研究及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要的試劑與儀器

趨磁細(xì)菌AMB-1(ATCC 700264)購(gòu)于ATCC菌株保藏中心，人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞由筆者實(shí)驗(yàn)室保存，量子點(diǎn)由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)梁高林教授提供.

趨磁細(xì)菌培養(yǎng)基：MSGM培養(yǎng)基(ATCC 1653)；HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基，Hycolon；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，Sigma公司.

JY96-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝；JEM-2100 高分辨透射電子顯微鏡(TEM)，日本島津；LEICA DMI4000B熒光倒置顯微鏡，德國(guó)萊卡.

1.2 趨磁細(xì)菌的培養(yǎng)及收集

將1 mL凍存于-80 ℃的趨磁細(xì)菌AMB-1菌株接種至10 mL MSGM培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)復(fù)蘇細(xì)菌.當(dāng)培養(yǎng)5 d后細(xì)菌濃度達(dá)到OD600=0.3～0.4時(shí)將菌體轉(zhuǎn)接到300 mL培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)4～6 d，待細(xì)菌濃度達(dá)到OD600=0.3～0.4時(shí)按照1∶10的比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng).為了收集細(xì)胞，將磁場(chǎng)強(qiáng)度為0.3 T的永磁鐵固定到培養(yǎng)瓶的外壁上，靜置放置2 h，待培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁上聚集大量的趨磁細(xì)菌時(shí)，去上清，將收集到的趨磁細(xì)菌用去離子水重懸，并取出10 μL進(jìn)行TEM 表征實(shí)驗(yàn).

1.3 磁小體的分離提取

取出10 g凍存的趨磁細(xì)菌，重懸于100 mL緩沖液(20 mM PBS 100 mM NaCl pH 7.2)中，使用超聲破碎的方法裂解細(xì)菌，超聲功率為30%，開(kāi)2 s，關(guān)3 s分別進(jìn)行10 min和20 min超聲.根據(jù)磁小體的特性將永磁鐵固定在燒杯外表面，吸附分離出的磁小體30 min，緩慢倒掉上清液，再用50 mL PBS 緩沖液重新懸浮磁小體，反復(fù)清洗—磁吸附5次，去除殘留的細(xì)胞碎片，得到高純度的磁小體，最后將磁小體溶于緩沖液(20 mM PBS 100 mM NaCl pH 6.5)中使其濃度達(dá)到10 mg·mL-1，取出2 μL稀釋到10 μL進(jìn)行TEM 表征實(shí)驗(yàn).

1.4 磁小體的量子點(diǎn)修飾

取10 mg量子點(diǎn)溶于1 mL 緩沖液(20 mM PBS 100 mM NaCl pH 6.5)中，加入NHS和EDC各11 μmol 反應(yīng)30 min后，將反應(yīng)物混合物加至1 mL的磁小體中繼續(xù)反應(yīng)1 h.反應(yīng)完成后用永磁鐵吸附磁小體.并用去離子水反復(fù)清洗—磁吸附5次，最后用1 mL的緩沖液(20 mM PBS 100 mM NaCl pH 7.2)20 mM PBS重懸磁光載體.

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及磁小體轉(zhuǎn)入細(xì)胞

取HepG2細(xì)胞接種于10 mL DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%血清)中，放置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照5×105個(gè)/孔將細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后每孔中加入10 μL磁光載體，并分別在孵育1，2，3，4，5 h 后用PBS緩沖液反復(fù)清洗細(xì)胞3次，然后在熒光顯微鏡下觀測(cè)轉(zhuǎn)染情況.

2 結(jié)果與討論

2.1 趨磁細(xì)菌的磁吸附收集與表征

趨磁細(xì)菌由于形成磁小體可被永磁體所吸附，圖1A顯示經(jīng)過(guò)永磁鐵吸附之后，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁上有趨磁細(xì)菌聚集，表明磁吸附的方法能有效地分離收集富含磁小體的趨磁細(xì)菌.TEM對(duì)收集的趨磁細(xì)菌進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)在趨磁細(xì)菌體內(nèi)有成鏈狀排列的磁小體，如圖1B所示，這與前人報(bào)道一致[12]，表明成功地培養(yǎng)并收集了具有磁小體的趨磁細(xì)菌.

A：用0.3T的永磁體吸附趨磁細(xì)菌2h；B：TEM表征磁吸附收集的富含磁小體的趨磁細(xì)菌.圖1 磁鐵吸附趨磁細(xì)菌及趨磁細(xì)菌的TEM表征

2.2 磁小體的純化

磁小體鏈的長(zhǎng)度對(duì)于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)非常重要.如果磁小體鏈太長(zhǎng)不易轉(zhuǎn)染；若太短則在細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，也不能產(chǎn)生足夠大的磁矩用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；一般認(rèn)為5～10個(gè)磁小體的鏈?zhǔn)亲詈线m的，兼顧了穩(wěn)定性和后續(xù)的磁熱療作用的要求[9].實(shí)驗(yàn)中分別運(yùn)用10 min和20 min超聲時(shí)間來(lái)破碎菌體，提取磁小體鏈，并用TEM對(duì)其進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)超聲破碎10 min時(shí)，大部分的磁小體鏈的長(zhǎng)度超過(guò)10個(gè)磁小體(圖2A)，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)產(chǎn)生的磁小體鏈的長(zhǎng)度則為5～10個(gè)(圖2B).因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇20 min的超聲破碎時(shí)間.

A：超聲破碎10 min；B：超聲破碎20 min.圖2 TEM表征提取的磁小體

2.3 磁光載體的構(gòu)建

利用共價(jià)結(jié)合的方法將量子點(diǎn)修飾至磁小體表面構(gòu)建磁光載體，圖3A為磁光載體合成示意圖.通過(guò)反復(fù)清洗—磁吸附方法去除沒(méi)有連接到磁小體表面的量子點(diǎn)，得到的磁光載體樣品在透射電鏡下進(jìn)行觀察，能夠清晰地看到5 nm左右的量子點(diǎn)的存在，表明已成功地將量子點(diǎn)與磁小體結(jié)合在一起，完成了磁光載體的制備,結(jié)果如圖3B所示.

A:TEM表征磁光載體; B:箭頭標(biāo)記量子點(diǎn).圖3 磁光載體制備示意圖

2.4 磁光載體的細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

將磁光載體與細(xì)胞共孵育時(shí)，磁光載體可以通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞.用PBS溶液洗滌細(xì)胞以除去未進(jìn)入細(xì)胞的磁光載體.利用量子點(diǎn)的熒光特性，在熒光顯微鏡下觀察磁光載體進(jìn)入細(xì)胞的效率，將磁光載體和HepG2細(xì)胞共孵育，在不同的孵育時(shí)間(1，2，3，4，5 h)均可觀察到磁光載體不同程度地進(jìn)入細(xì)胞中，其中孵育3 h時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到100%，如圖4所示.

A：孵育后的細(xì)胞在熒光下的顯微圖像；B：孵育后的細(xì)胞在明場(chǎng)下的顯微圖像；C：熒光成像與明場(chǎng)成像的疊加圖.圖4 HepG2細(xì)胞加入磁光載體孵育3 h后的顯微圖

圖4顯示，由量子點(diǎn)發(fā)出紅色的熒光(圖4A)與明場(chǎng)視野下的細(xì)胞形態(tài)(圖4B)能很好地相重疊(圖4C)，表明磁光載體已成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)也驗(yàn)證了可以利用量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)對(duì)磁光載體進(jìn)行光示蹤.

3 結(jié)束語(yǔ)

磁靶向熱療是近年來(lái)靶向給藥系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)，磁小體可在磁場(chǎng)的調(diào)控下靶向至腫瘤組織，同時(shí)在交變磁場(chǎng)下能夠產(chǎn)生足夠的熱量，從而有效殺死腫瘤細(xì)胞.因此腫瘤的磁小體給藥治療及磁熱療日益受到廣泛的關(guān)注.量子點(diǎn)具有良好的生物兼容性、無(wú)毒性，其受激發(fā)后發(fā)出的近紅外光具有有效穿透組織達(dá)到實(shí)時(shí)定位的作用.筆者用帶有羧基的CdTe/CdS量子點(diǎn)作為修飾材料，對(duì)趨磁細(xì)菌 AMB-1天然合成的具有生物膜包被的磁小體進(jìn)行修飾，得到同時(shí)具有光磁特性的磁光載體.將磁光載體與HepG2細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)轉(zhuǎn)染，熒光顯微觀察表明可以利用量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)對(duì)磁光載體進(jìn)行光定位.期望該研究結(jié)果能為將來(lái)的腫瘤及癌癥的治療提供有利的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),對(duì)將來(lái)的應(yīng)用研究具有一定的意義.

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