吳娜 李多 于永強(qiáng)

[摘要] 目的 探究ATG16L1與半乳糖凝集素-9（Gal-9）對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）活動(dòng)性判定中的價(jià)值。 方法 選擇2015年3月～2016年3月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）進(jìn)行治療的80例UC患者為觀(guān)察組，另選取同期于我院進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查無(wú)異常者20例作為對(duì)照組，使用改良Mayo評(píng)分系統(tǒng)對(duì)UC的活動(dòng)性進(jìn)行評(píng)估。采用Spearman相關(guān)分析觀(guān)察組患者ATG16L1、Gal-9表達(dá)水平與Mayo評(píng)分的相關(guān)性。 結(jié)果 觀(guān)察組ATG16L1的相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均顯著低于對(duì)照組（P < 0.05），觀(guān)察組Gal-9相對(duì)表達(dá)量和表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于對(duì)照組（P < 0.05）。ATG16L1相對(duì)表達(dá)量和陽(yáng)性率與Mayo評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.78，P < 0.05；rs=-0.80，P < 0.05），Gal-9相對(duì)表達(dá)量和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與Mayo評(píng)分呈顯著正相關(guān)（均rs=0.81，P < 0.05）。 結(jié)論 ATG16L1和Gal-9的表達(dá)與UC的活性密切相關(guān)，可作為判斷UC活性的指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] ATG16L1；半乳糖凝集素-9；潰瘍性結(jié)腸炎；活動(dòng)性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R574.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）03（a）-0066-04

[Abstract] Objective To explore the value of ATG16L1 and galectin-9 （Gal-9） in judging the activity of ulcerative colitis （UC）. Methods From March 2015 to March 2016， 80 patients with UC in the First Affiliated Hospital of Hebei North University （“our hospital” for short） were selected as the observation group， and 20 patients with no intestinal disease over the same period as the control group. The UC activity was evaluated using the modified Mayo scoring system evaluation. Spearman correlation was used to analyze the correlation between the expression level of ATG16L1 gal-9 in the observation group and the Mayo score. Results The relative expression of ATG16L1 and the protein positive expression rate in the observation group were significantly lower than those in the control group （P < 0.05）， and the relative expression of Gal-9 and the positive expression rate in the observation group were significantly higher than those in the control group （P < 0.05）. The relative expression level and positive rate of ATG16L1 showed a significant negative correlation with Mayo score （rs=-0.78，P < 0.05；rs=-0.80，P < 0.05）. The relative expression level of Gal-9 and the protein positive rate showed a significant positive correlation with Mayo score （all rs=0.81，P < 0.05）. Conclusion The expression of ATG16L1 and Gal-9 is closely related to the activity of UC， which can be used as an index to judge the activity of UC.

[Key words] ATG16L1； Galectin-9； Ulcerative colitis； Activity

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）病變部位可遍及整個(gè)結(jié)腸，其病程長(zhǎng)并容易反復(fù)發(fā)作[1-2]。在治療過(guò)程需對(duì)UC的活動(dòng)性及逆行及時(shí)評(píng)估和隨訪(fǎng)，但目前尚無(wú)統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)并且缺乏特異性[3]。ATG16L1編碼的蛋白參與細(xì)胞的自噬，與UC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。而半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）參與機(jī)體炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，細(xì)胞自噬異常會(huì)引起Gal-9水平的波動(dòng)[5]。目前國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)關(guān)于Gal-9、ATG16L1與UC活動(dòng)性的相報(bào)道，本文主要研究Gal-9、ATG16L1對(duì)與UC活動(dòng)性判定中的價(jià)值，為Gal-9、ATG16L1指導(dǎo)UC的臨床治療提供新的治療方法及依據(jù)。現(xiàn)將報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月～2016年3月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）80例UC患者為觀(guān)察組，其中男43例，女37例；平均年齡（40.56±4.43）歲。另選取同期于我院進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查無(wú)異常者20例作為對(duì)照組，男11例，女9例，平均年齡（38.22±4.07）歲。兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在20～80歲；②符合2012年炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)[6]中對(duì)于UC的診斷標(biāo)準(zhǔn)；③各項(xiàng)檢查資料完整；④患者及患者家屬均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①過(guò)去3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑等；②合并心血管疾病和肝腎疾?。虎酆喜盒阅[瘤；④合并其他自身免疫性疾??；⑤哺乳以及妊娠期婦女。

1.3 方法

1.3.1 疾病活動(dòng)性評(píng)估 本次研究中使用改良Mayo評(píng)分系統(tǒng)[7]對(duì)UC的活動(dòng)性進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估項(xiàng)目包括：排便次數(shù)、便血情況、內(nèi)鏡表現(xiàn)以及總體評(píng)價(jià)，根據(jù)患者實(shí)際情況與患者健康時(shí)自身情況，每項(xiàng)進(jìn)行0～3分的評(píng)分，總分為12分，分?jǐn)?shù)越高表示越嚴(yán)重。根據(jù)評(píng)分可分為：①臨床緩解期≤2分；②輕度活動(dòng)3～5分；③中度活動(dòng)6～10分；④重度活動(dòng)11～12分。

1.3.2 ATG16L1、Gal-9相關(guān)PCR檢測(cè) 所有患者在結(jié)腸鏡檢查時(shí)分別采集結(jié)腸黏膜標(biāo)本3份，其中1份使用熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，具體操作方法如下[7-8]：將標(biāo)本在液氮保護(hù)下研磨，使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒提取總RNA，試劑盒購(gòu)買(mǎi)于Takara公司（RT-reagent），熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于Takara公司（SYBRPremixExTaq）嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)方法操作。擴(kuò)增體系為1 L cDNA加入到10 L去離子水，95℃預(yù)變性1 min；變性：95℃下15 s，退火：60℃下30 s，延伸：72℃，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，比較。ATG16L1上游引物5′-GGCTGTACCGTGTTTCCT～TAG-3′，下游引物5′-CTTCATGGCAAGTGG-TTGTAC-3′；Gal-9上游引物5′-GGCTGTACCGTGTTTCCT～TAG-3′，下游引物5′- GTGAAGGTGACAGCAGTCGGT-T-3′均為自行設(shè)計(jì)。

1.3.3 ATG16L1、Gal-9相關(guān)免疫組化檢測(cè) 將“1.3.2”中另兩份樣本及逆行免疫組化檢測(cè)，具體方法如下：將樣本及逆行固定、脫蠟處理，3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，后用PBS沖洗，再放入枸櫞酸鈉緩沖液高壓煮沸2 min，后用PBS沖洗。分別滴加小鼠抗人ATG16L1、Galectin-9單克隆抗體（購(gòu)買(mǎi)于上海信裕生物科技有限公司），陰性對(duì)照用PBS代替，4℃孵育24 h。復(fù)溫40 min，PBS沖洗，滴加鼠二抗工作液，室溫孵化1 h后PBS沖洗，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫15 minPBS沖洗。DAB顯色10 min，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，顯色滿(mǎn)意后自來(lái)水沖洗，后用蘇木精復(fù)染。清水沖洗后氨水返藍(lán)，封片。每張切片隨機(jī)選取8個(gè)高倍視野，細(xì)胞顏色包括無(wú)色、淺黃色、黃色、棕黃色和棕褐色，著色比例大于30%并且顏色為黃色、棕黃色、棕褐色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，表達(dá)陽(yáng)性率用每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞比例表示，陽(yáng)性率=（視野中陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)/視野中總細(xì)胞數(shù)）×100%，取8個(gè)視野的平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman相關(guān)分析觀(guān)察組患者ATG16L1、Gal-9表達(dá)水平與Mayo評(píng)分的相關(guān)性，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組ATG16L1、Gal-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

觀(guān)察組ATG16L1的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P < 0.05），觀(guān)察組Gal-9相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組ATG16L1、Gal-9蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較

觀(guān)察組ATG16L1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于對(duì)照組（P < 0.05），觀(guān)察組Gal-9蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 觀(guān)察組不同UC活動(dòng)性ATG16L1、Gal-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較以及相關(guān)性比較

隨著Mayo評(píng)分的升高，TG16L1以及Gal-9相對(duì)表達(dá)量顯著升高，其中ATG16L1相對(duì)表達(dá)量與UC活動(dòng)性呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.78，P=0.000），Gal-9相對(duì)表達(dá)量與UC活動(dòng)性呈顯著正相關(guān)（rs=0.81，P=0.000）。見(jiàn)表3。

2.4 觀(guān)察組不同UC活動(dòng)性ATG16L1、Gal-9蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較以及相關(guān)性比較

觀(guān)察組內(nèi)不同UC活動(dòng)性組間的ATG16L1、Gal-9表達(dá)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），隨著Mayo評(píng)分的升高，TG16L1以及Gal-9陽(yáng)性率顯著升高，其中ATG16L1表達(dá)陽(yáng)性率與UC活動(dòng)性呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.80，P=0.000），Gal-9表達(dá)陽(yáng)性率與UC活動(dòng)性呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（rs=0.81，P=0.000）。見(jiàn)表4。

3 討論

近年來(lái)調(diào)查發(fā)現(xiàn)UC在我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[9]。UC的治療目的是達(dá)到結(jié)腸黏膜的愈合，而UC是一種病程長(zhǎng)、極易反復(fù)發(fā)作的疾病，其活動(dòng)性治療過(guò)程中處于不斷變化的過(guò)程中，因此對(duì)于UC治療過(guò)程中，對(duì)UC活動(dòng)性評(píng)估對(duì)治療有著重要的指導(dǎo)作用，腸鏡檢查雖較直觀(guān)，但缺乏客觀(guān)性，并且過(guò)程較為繁瑣。Mayo評(píng)分雖被廣泛的應(yīng)用于臨床，但是其缺乏直觀(guān)性，并且評(píng)估結(jié)果極易受到影響[10]。研究表明UC屬于不明原因的非特異性炎性疾病，與腸道免疫系統(tǒng)異常密切相關(guān)[11]。自噬可通過(guò)溶酶體清除受損的細(xì)胞器以及死亡細(xì)胞等，不會(huì)引起炎性反應(yīng)[12]。ATG16L1編碼的蛋白是與自噬過(guò)程中最重要蛋白當(dāng)ATG16L1表達(dá)異常會(huì)擾亂細(xì)胞自噬過(guò)程，導(dǎo)致炎性發(fā)生[13]。研究表明ATG16L1基因多態(tài)性與IBD的發(fā)生密切相關(guān)[14]。本研究結(jié)果提示不同UC活動(dòng)性的患者中，ATG16L1的mRNA相對(duì)表達(dá)量與ATG16L1表達(dá)陽(yáng)性率存在顯著差異，其水平與Mayo評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)。自噬缺陷可能會(huì)引起炎性反應(yīng)，甚至加劇自身免疫性疾病，研究推測(cè)自噬異常會(huì)導(dǎo)致DC遞呈微生物抗原到達(dá)腸淋巴細(xì)胞，使T細(xì)胞激活受損且分泌炎性因子減少，從而導(dǎo)致腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，誘發(fā)UC[15-16]。本研究結(jié)果提示ATG16L1表達(dá)水平在UC活動(dòng)性判定中具有一定價(jià)值。

細(xì)菌感染也是導(dǎo)致UC的重要原因，腸黏膜受損細(xì)菌侵入引會(huì)起免疫反應(yīng)[17]。既往研究表明，在正常生理?xiàng)l件下Gal-9表達(dá)極少，但在一些炎性因子IFN-γ、IL-1β等的刺激下表達(dá)增加[18]。近年來(lái)研究表明，彎曲菌侵入可誘發(fā)UC，并使單層腸上皮表達(dá)Gal-9的水平顯著增高，同時(shí)ATG16L1表達(dá)異常導(dǎo)致炎性也會(huì)引起Gal-9的水平升高[19]。本研究結(jié)果提示不同UC活動(dòng)性的患者中，Gal-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量與表達(dá)陽(yáng)性率存在顯著差異，其水平與Mayo評(píng)分呈顯著正相關(guān)。IFN-γ、IL-1β可通過(guò)激活細(xì)胞及B細(xì)胞，促進(jìn)產(chǎn)生下游細(xì)胞因子，從而發(fā)揮免疫上調(diào)作用，同時(shí)也可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞釋放炎性因子，發(fā)揮促炎癥作用，說(shuō)明Gal-9可作為一種反應(yīng)UC活動(dòng)性的評(píng)價(jià)指標(biāo)[20]。

綜上所述，UC患者ATG16L1、Gal-9表達(dá)水平存在顯著異常，并且不同UC活動(dòng)性間的ATG16L1、Gal-9表達(dá)水平存在顯著差異，ATG16L1表達(dá)水平與Mayo評(píng)分呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，Gal-9表達(dá)水平與Mayo評(píng)分呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，可作為判定UC活動(dòng)性的指標(biāo)。

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