董麗莎，李妍妍，張紅燕，崔晨茜，韓姣姣，王朝陽，司開學(xué)，周 君，蘆晨陽，蘇秀榕,*

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.康奈爾大學(xué)農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)學(xué)院，美國(guó) 紐約州 伊薩卡 14853）

膠原蛋白多肽是膠原蛋白經(jīng)過酶解等降解后生成的產(chǎn)物[1]，不會(huì)受到消化酶的二次水解，能夠直接吸收，可減輕消化道的負(fù)擔(dān)，有利于體弱者[2]。同時(shí)，它還具有人體調(diào)節(jié)功能，提高免疫力，改善細(xì)胞代謝，以及抗衰老[3]，消除體內(nèi)自由基等生理功能?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)水解膠原蛋白中有多種活性肽：抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性肽[4]、抗氧化肽[5-6]、抗菌肽等。

我國(guó)年產(chǎn)鱈魚逾50萬 t，這些漁業(yè)產(chǎn)品在加工成凍魚塊或凍魚排產(chǎn)品時(shí)，約30%鮮質(zhì)量成為加工副產(chǎn)品，其中魚皮占8%左右[7-8]。這些副產(chǎn)品通常用來干制粉碎用于制造動(dòng)物蛋白飼料，經(jīng)過粗加工制成的產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高。黑線鱈魚皮是較好的膠原蛋白來源。它的加工廢棄物如果能夠用于膠原的提取和加工，必定能夠提高黑線鱈的附加值。本研究以黑線鱈魚皮膠原蛋白為原料來酶解制備多肽，通過胰蛋白酶進(jìn)行單因素和響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定最佳酶解工藝條件后，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight tandem mass spectrometry，MALDI-TOF MS/MS）測(cè)定酶解液中的優(yōu)勢(shì)肽序列，并通過分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)肽抗氧化的作用機(jī)制。最后通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證黑線鱈魚皮膠原蛋白酶解多肽對(duì)光損傷的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；黑線鱈魚皮膠原蛋白凍干粉 日本新田有限公司。

胰蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；總氨基酸、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸緩沖液 美國(guó)Hyclone公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）粉 美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國(guó)Amresco公司；0.25%胰蛋白酶＋乙二胺四乙酸 美國(guó)Gbico公司；細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

5800 MALDI-TOF MS/MS儀 美國(guó)AB SCIEX公司；Discovery Studio 2017 美國(guó)Accelrys公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白胰蛋白酶酶解工藝優(yōu)化

以水解度為指標(biāo)，pH值為7.0、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的條件下，研究胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)水解效果的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以酶解溫度、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解時(shí)間為自變量，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)[9]。水解度計(jì)算如式（1）所示：

1.3.2 膠原蛋白多肽組成分析

采用MALDI-TOF MS/MS對(duì)酶解液進(jìn)行測(cè)定。離子源加速電壓為20 kV，N2激光器，激光波長(zhǎng)337 nm，能量5 800，離子延遲提取時(shí)間390 ns，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加2 000 次，使用標(biāo)準(zhǔn)多肽校準(zhǔn)品（peptideII standard kit（Bruker））離子峰校正（m/z 500～3 000）質(zhì)量掃描范圍500～3 000 u。MALDI-TOF MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果用本地MASOT軟件查詢NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)（2367365 sequences；802797248 residues）進(jìn)行檢索[10]。

1.3.3 Discovery Studio的篩選與分子對(duì)接

1.3.3.1 小分子配體準(zhǔn)備

用Discovery Studio 2017中Build and Edit Protein模塊將1.3.2節(jié)獲得的多肽氨基酸序列輸入獲得未經(jīng)處理的多肽3D結(jié)構(gòu)，并通過Minimize Ligands模塊中的Full Minimization功能將其能量最優(yōu)化，以獲得最佳能量的多肽3D結(jié)構(gòu)。由于配體數(shù)目較多，并考慮到對(duì)映異構(gòu)體等因素，使用Protocol中的Prepare Ligands處理該體系。

1.3.3.2 蛋白質(zhì)受體準(zhǔn)備與活性位點(diǎn)的確定

PDB數(shù)據(jù)庫(kù)是目前最主要的蛋白質(zhì)分子數(shù)據(jù)庫(kù)，從中檢索并下載Keap1，其ID號(hào)為5DAD。將5DAD在DS中打開后，去水加氫，并用Prepare Protein對(duì)蛋白進(jìn)行預(yù)處理，包括在不同pH值條件下的質(zhì)子化狀態(tài)、缺失loop的補(bǔ)充等。在Tools Explorer中的Define Receptor將處理好的5DAD蛋白分子定義為受體分子，展開Define and Edit Binding Site，將活性位點(diǎn)指定在受體蛋白中自帶的小分子配體處。

1.3.3.3 分子對(duì)接

在Tools Explorer中，展開Receptor-Ligand Interactions模塊，點(diǎn)擊CDOCKER，打開相應(yīng)參數(shù)面板。在參數(shù)面板中，將Input Receptor設(shè)置為5DAD-prep:5DAD后運(yùn)行。

1.3.4 多肽抗氧化活性分析

1.3.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞融合90%以上時(shí)傳代，經(jīng)0.5%胰蛋白酶消化，離心計(jì)數(shù)后備用[11]。

1.3.4.2 多肽對(duì)細(xì)胞增殖的影響

將HaCaT細(xì)胞以105個(gè)/mL、每孔100 μL接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h后，MTT法測(cè)定其吸光度，確定多肽最佳質(zhì)量濃度[12]。細(xì)胞增殖率計(jì)算如式（2）所示：

膠原蛋白多肽對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖具有一定的促進(jìn)作用，且在一定范圍內(nèi)，隨膠原蛋白多肽質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)多肽質(zhì)量濃度為250 mg/mL時(shí)，膠原蛋白多肽對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用達(dá)到最大值。選擇150、250、350 mg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4.3 細(xì)胞分組

將HaCaT細(xì)胞分為空白對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，不用戶外紫外線（ultraviolet radiation B，UVB）輻射）、UVB輻射模型組（DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，采用UVB輻射）、MP處理組（分別用1.3.4.2節(jié)中挑選的3 個(gè)質(zhì)量濃度膠原蛋白多肽DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再用UVB輻射，分別記作酶解多肽低、中、高劑量組）。每組細(xì)胞都有6 個(gè)復(fù)孔，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基，加入適量磷酸緩沖液覆蓋細(xì)胞，再用30 mJ/cm2劑量UVB輻射?？瞻讓?duì)照組需要用鋁箔紙覆蓋。

1.3.4.4 指標(biāo)測(cè)定

按照1.3.2節(jié)步驟處理各組細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞及上清液，并根據(jù)各試劑盒說明書測(cè)定MDA含量、SOD和GSH-Px活性。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率[13]，利用Modfit LT軟件進(jìn)行分析[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)進(jìn)行最小顯著差異兩兩比較。檢驗(yàn)顯著性水平（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 胰蛋白酶酶解膠原蛋白的單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Effects of variables on degree of hydrolysis

如圖1所示，水解度隨酶解時(shí)間、酶解溫度的升高呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，而膠原蛋白隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)出先增大后穩(wěn)定的趨勢(shì)。最適酶解條件為1.0～2.0 h、45～55 ℃、0.5%～1.5%的胰蛋白酶。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用SAS 9.0進(jìn)行回歸擬合，得到各因素變量間的方程式為：Y=84.356 67＋0.015 000X1－0.586 25X2＋0.156 25X3－0.93X1X2－1.32X1X3＋2.087 50X2X3－

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果Table 1 Experimental design used in response surface methodology along with measured and predicted degree of hydrolysis

表2 回歸方程的方差分析Table 2 Analysis of variance of regression equation

黑線鱈魚皮膠原蛋白水解度的回歸模型極顯著（P＜0.01），回歸方程的失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），這表明酶解溫度、酶解時(shí)間、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)膠原蛋白水解度影響的顯著程度高，同時(shí)3 個(gè)因素又可以與水解度進(jìn)行很好的擬合。相關(guān)系數(shù)R2為94.31%，說明該回歸方程的可靠性比較高。模型變異系數(shù)為3.39%，說明試驗(yàn)穩(wěn)定性好、操作可靠，基于以上分析可知，3 個(gè)因素水平設(shè)計(jì)合理、方法可行，因此，該模型可用于分析數(shù)據(jù)。從表2可以看出，二次項(xiàng)X12、X22、X32對(duì)胰蛋白酶酶解膠原蛋白水解度有極顯著影響，一次項(xiàng)X1、X2、X3和交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3對(duì)其影響不顯著。這表明各個(gè)因素對(duì)膠原蛋白水解度影響呈二次關(guān)系，且各因素之間有較強(qiáng)的交互作用。

圖2 膠原蛋白水解度的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 2 Response surfaces and contour plots showing individual and interactive effects of variables on the degree of hydrolysis of collagen

三維響應(yīng)面及等高線圖見圖2，3 個(gè)因素與水解度呈拋物線關(guān)系，隨著各因素水平增加，在一定范圍內(nèi)，水解度呈不同程度的增加。但超過一定界限，水解度呈下降的趨勢(shì)，各因素變化程度符合上述回歸方程。3 個(gè)因素在特定范圍內(nèi)水解度達(dá)到最大值。綜合響應(yīng)面數(shù)學(xué)分析，得到最優(yōu)水解條件為酶解時(shí)間1.75 h、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.23%、酶解溫度52.95 ℃，水解度理論預(yù)測(cè)值為74.22%。采用上述優(yōu)化酶解條件測(cè)得的膠原蛋白水解度為78.33%。試驗(yàn)值與理論預(yù)測(cè)值有較好的擬合性，表示采用響應(yīng)面優(yōu)化參數(shù)在實(shí)踐中是可行的。

2.3 膠原蛋白多肽種類的確定

表3 黑線鱈魚皮膠原蛋白多肽的鑒定Table 3 Identification of peptides in collagen hydrolysate from Melanogrammus aeglefinus skin

MALDI-TOF MS/MS共檢測(cè)到1 026 個(gè)峰，其中僅有3 個(gè)相對(duì)較強(qiáng)的質(zhì)譜峰，分別為m/z 1 267.512 8、m/z 783.315 0和m/z 602.241 5。選擇它們作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜處理。得到3 個(gè)優(yōu)勢(shì)多肽，見表3和圖3。

圖3 膠原蛋白多肽的質(zhì)譜分析圖Fig. 3 Mass spectra of polypeptides derived from fish skin collagen

2.4 膠原蛋白多肽與Keap1分子對(duì)接

CDocker 分子對(duì)接方式結(jié)果主要根據(jù)受體與配體相互作用的能量（CDocker interaction energy，ECI），范德華力（Van der Waals Energy，EVDW）等信息來確定結(jié)合的程度。ECI值越低表示分子對(duì)接過程中受體與配體的相互作用越小，結(jié)合的越緊密。如表4所示，配體小分子V-IFFVTMGTP-R（1）與受體蛋白結(jié)合所需的能量最低，結(jié)合最緊密，遠(yuǎn)低于其他配體。由圖4可看出，參與1號(hào)配體小分子與Keap1中的相互作用的氨基酸殘基共13個(gè)，其中配體小分子與Arg135、Glu138、Glu134、Asp87形成電荷吸引力，與Lys131、Lys150形成氫鍵能，與Gly148形成碳?xì)滏I能，與Met147、Val155、Cys151、His154、His129、Tyr85形成烷基鍵能和π烷基鍵能，由此可以推測(cè)，1號(hào)配體能夠與Keap1蛋白相互結(jié)合，并抑制其活性，從而阻斷Nrf2信號(hào)通路，以達(dá)到抗氧化的作用。

表4 分子對(duì)接結(jié)果Table 4 Molecular docking

圖4 分子對(duì)接結(jié)果Fig. 4 Schematic of molecular docking

2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 膠原蛋白多肽對(duì)HaCaT細(xì)胞活性的影響

UVB模型組細(xì)胞活性與空白對(duì)照組對(duì)比，極顯著降低（P＜0.01）。而250 mg/mL中劑量組的膠原蛋白多肽處理的HaCaT細(xì)胞活性達(dá)到最大值，與模型組相比，極顯著增高（P＜0.01），表明膠原蛋白多肽能夠有效抑制光損傷作用（圖5）。

圖5 各組HaCaT細(xì)胞的活性Fig. 5 Viability of HaCaT cells under different treatment conditions

2.5.2 膠原蛋白多肽對(duì)HaCaT細(xì)胞MDA含量和SOD、GSH-Px活性的影響

模型組與空白對(duì)照組相比MDA含量上升，SOD活性與GSH-Px活性極顯著下降（P＜0.01），表明造模成功。膠原蛋白多肽各劑量組中，中劑量組的MDA含量降低較其他兩組更明顯，SOD和GSH-Px活性上升也較其他兩組更高，且較模型組均呈極顯著變化（P＜0.01），表明膠原蛋白多肽能在一定程度上抑制UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞的氧化損傷（圖6）。

圖6 各處理組對(duì)HaCaT細(xì)胞MDA濃度和SOD、GSH-Px活性的影響Fig. 6 Effects of different treatments on MDA, SOD, and GSH-Px levels of HaCaT cells

2.5.3 膠原蛋白多肽對(duì)HaCaT細(xì)胞調(diào)亡和周期的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組的正常細(xì)胞數(shù)下降了14.5%；與模型組相比，膠原蛋白多肽中劑量組的正常細(xì)胞數(shù)上升了12.3%，凋亡早期細(xì)胞下降11.1%，凋亡晚期的細(xì)胞下降了1.2%（圖7），較低劑量組與高劑量組正常細(xì)胞數(shù)量更接近于空白對(duì)照組。

圖7 膠原蛋白多肽對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的作用Fig. 7 Effects of different treatments on apoptosis in HaCaT cells

3 討 論

3.1 膠原蛋白多肽抗氧化的分子虛擬篩選

分子對(duì)接方法已成為藥物設(shè)計(jì)方法中比較成熟的直接藥物設(shè)計(jì)方法。它能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)受體與配體間的結(jié)合位點(diǎn)，指導(dǎo)和解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象[15-17]。Discovery Studio是一款面向生命科學(xué)領(lǐng)域的綜合模擬軟件，主要用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)受體與配體間氨基酸相互作用的準(zhǔn)確率高達(dá)96%。劉廣斌等[18]已通過Discovery Studio模擬Hsrad51蛋白與多肽brc4的分子對(duì)接，該結(jié)果為今后研究Hsrad51蛋白與其他重復(fù)基元的分子對(duì)接以及相互作用提供了重要依據(jù)。鄭春松等[19]用Discovery Studio成功預(yù)測(cè)獨(dú)活寄生湯對(duì)TNF-α和IL-1β作用的活性成分，為其臨床使用提供一定的研究依據(jù)。

Keap1蛋白Nrf2的胞漿抑制蛋白，正常情況下錨定于胞漿的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上。Nrf2蛋白在未受誘導(dǎo)的正常細(xì)胞里，Nrf2的代謝相當(dāng)快，半衰期只有10～30 min。但當(dāng)細(xì)胞受到活性氧刺激后，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，活化的Nrf2轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，激活靶基因表達(dá)，調(diào)控2相代謝酶、抗氧化酶或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮抗氧化損傷的作用[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，3 種MP的分子對(duì)接結(jié)果顯示，與Keap1相互作用的共同氨基酸有HIS129、TYR85、LYS131、VAL155、ARG135，它們?cè)诮Y(jié)合過程中起著重要的作用。從而預(yù)測(cè)膠原蛋白多肽與Keap1蛋白結(jié)合后，能夠刺激其與Nrf2蛋白的解偶聯(lián)，發(fā)揮抗氧化作用，進(jìn)而對(duì)正常細(xì)胞起到抗氧化的保護(hù)效應(yīng)。

3.2 膠原蛋白多肽抗氧化活性

長(zhǎng)期暴露于紫外輻射，尤其是UVB會(huì)導(dǎo)致色素沉著、老化、皮膚癌等。為了減弱UVB輻射所引起的光損傷，應(yīng)用天然抗氧化劑成為人們保護(hù)皮膚的有效措施[21-23]。呂玲玲等[24]酶解法制得林蛙皮膠原蛋白多肽，并研究抗氧化性得出林蛙皮膠原蛋白具有一定的還原能力，并且在一定范圍內(nèi)，隨著濃度的增加其抗氧化的能力逐漸增強(qiáng)。竇梅等[25]建立UVA氧化損傷人角質(zhì)形成細(xì)胞病理模型，探討了扇貝多肽對(duì)單次UVA氧化損傷體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)扇貝多肽在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能劑量依賴性降低HaCaT細(xì)胞質(zhì)MDA水平，提高SOD、GSH-Px活性。人角質(zhì)形成細(xì)胞作為表皮的主要構(gòu)成是UVB輻射的靶細(xì)胞。而正常細(xì)胞有正常的抗氧化體系，主要有酶促和非酶促體系[26]。酶促體系包括SOD和GSH-Px等，非酶促體系包括維生素、輔酶、抗壞血酸等。SOD能夠清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[27]，MDA的量主要反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細(xì)胞受損程度。MDA常與SOD同時(shí)測(cè)定：SOD間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA反映了細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)的一種催化過氧化氫分解的酶，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[28]。本研究通過體外培養(yǎng)HaCaT，采用30 mJ/cm2的UVB照射，使得HaCaT內(nèi)SOD、GSH-Px活性顯著降低（P＜0.01），而MDA含量顯著升高（P＜0.01），說明UVB可通過抑制SOD、GSH-Px活性的防御系統(tǒng)，降低其清除活性氧族的能力，使機(jī)體自由基堆積，脂質(zhì)過氧化物含量增多，造成細(xì)胞及組織的損傷；而加入膠原蛋白多肽的實(shí)驗(yàn)組卻可顯著抑制UVB導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性下降，降低MDA的產(chǎn)生。用MTT法檢測(cè)到膠原蛋白多肽對(duì)UVB輻射細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示膠原蛋白多肽各劑量組的細(xì)胞活性百分比均顯著高于模型組而較空白組低。說明UVB可以造成體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞增殖活力下降，而膠原蛋白多肽在250 mg/mL時(shí)可提高HaCaT的增殖活力。細(xì)胞凋亡的途徑最主要的是內(nèi)源性凋亡途徑，內(nèi)源性凋亡途徑可由多種因素誘發(fā)，如細(xì)胞脫離了原來的生長(zhǎng)環(huán)境，DNA受到損傷等[29]。在線粒體內(nèi)、外膜之間存在線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔，它的發(fā)生在細(xì)胞凋亡中扮演著極其重要的角色，而引起線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放的主要因素為細(xì)胞外源性損傷，包括氧化應(yīng)激過度，Ca2＋超載，藥物誘導(dǎo)等[30]。Annexin V-FITC/PI法細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示，黑線鱈魚皮膠原蛋白多肽250 mg/mL與模型組相比。在凋亡早期和凋亡晚期階段，均有顯著的抑制作用。說明該膠原蛋白多肽對(duì)HaCaT細(xì)胞的凋亡有抑制作用。

綜上所述，分子對(duì)接結(jié)果表明黑線鱈魚皮膠原蛋白胰蛋白酶酶解得到的3 種多肽均能與Keap1對(duì)接，該對(duì)接位點(diǎn)的信息對(duì)分析多肽類化合物激活Keap1活性的分子機(jī)制提供了依據(jù)，有助于多肽類物質(zhì)用于抗氧化損傷相關(guān)藥物的研發(fā)。UVB輻射使HaCaT細(xì)胞活性下降了21.04%，而經(jīng)膠原蛋白多肽處理，尤其是250 mg/mL處理的HaCaT細(xì)胞的損傷程度明顯減輕，活性上升了39.29%，細(xì)胞內(nèi)的MDA含量顯著下降（P＜0.01），SOD和GSH-Px活性顯著提高（P＜0.01），表明該膠原蛋白多肽對(duì)UVB輻射損傷具有顯著的光損傷保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]成曉瑜, 張順亮, 戚彪, 等. 膠原與膠原蛋白多肽的結(jié)構(gòu)功能及其應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J]. 肉類研究, 2011, 25(12): 33-39.

[2]WATANABE-KAMIYAMA M, SHIMIZU M, KAMIYAMA S, et al.Absorption and effectiveness of orally administered low molecular weight collagen hydrolysate in rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(2): 835-841. DOI:10.1021/jf9031487.

[3]OESSER S, SEIFERT J. Stimulation of type II collagen biosynthesis and secretion in bovine chondrocytes cultured with degraded collagen[J]. Cell Tissue Research, 2003, 311(3): 393-399.

[4]曾名勇, 陳勝軍, 李來好, 等. 紅非鯽魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的分離及其部分特性[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2007, 11(2): 397-400. DOI:10.3321/j.issn:1673-8225.2007.02.028.

[5]MENDIS E, RAJAPAKSE N, KI S K. Antioxidant properties of a radical-seavenging peptide purified from enzymatically prepared fish skin gelatin hydrolysate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(3): 581-587. DOI:10.1021/jf048877v.

[6]朱夕波, 周培根, 李燕, 等. 豬皮膠原蛋白水解產(chǎn)物中的抗氧化活性肽的分離及其氨基酸組分[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2009, 21(1):122-124; 182. DOI:10.3969/j.issn.1001-6880.2009.01.028.

[7]KOCHANEK K S, WIASCHEK M, SCHAUEN M, et al. UV-induced reactive oxygen species in photocarcinogenesis and photoaging[J].Biological Chemistry, 2007, 78(3)： 1247-1257.

[8]RYOO Y W, SUH S I, MUN K C, et al. The effects of the melatonin on ultraviolet-B irradiated cultured dermal fibroblasts[J]. Journal of Dermatological Science, 2001, 27(3)： 162-169. DOI：10.1016/S0923-1811(01)00133-5.

[9]侯付景, 金春華, 董明敏, 等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化海地瓜酶解工藝及其抗氧化活性的研究[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2010, 32(3): 276-280.

[10]楊帆, 敬海明, 張拓, 等. MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用分析大鼠腦脈絡(luò)叢的多肽組[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2010,26(7): 659-671.

[11]蔡江佳, 李曄, 蘇秀榕, 等. 魷魚皮膠原蛋白對(duì)H2O2誘導(dǎo)MC3T3-E1損傷的修復(fù)作用[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2015, 15(1): 6-12.DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.01.002.

[12]王鴻飛, 飛劉, 超徐, 等. 費(fèi)菜總黃酮調(diào)節(jié)血脂及對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的作用[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2013, 13(4): 23-26.

[13]童茜茜, 徐嘉杰, 蘇秀榕, 等. 小球藻精油對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2016, 16(5): 25-31. DOI:10.16429/j.1009-7848.2016.05.004.

[14]李曄, 陳蕾, 李振, 等. 浙江枝吻紐蟲凝溶膠蛋白基因的原核表達(dá)產(chǎn)物抗腫瘤活性的研究[J]. 海洋與湖沼, 2012, 43(4): 756-760.

[15]段愛霞, 陳晶, 劉宏德, 等. 分子對(duì)接方法的應(yīng)用與發(fā)展[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 4(6): 473-477.

[16]ULRIKE G, TERESA K, FLORIAN P, et al. Accessing biological actions of Ganoderma secondary metabolites by in silico profiling[J].Phytochemistry, 2015, 114(4): 114-126.

[17]WU Q, JIA J, YAN H, et al. A novel angiotensin-I converting enzyme(ACE) inhibitory peptide from gastrointestinal protease hydrolysate of silkworm pupa (Bombyx mori) protein: biochemical characterization and molecular docking study[J]. Peptides, 2015, 68(2): 17-24.

[18]劉廣斌, 趙東欣, 馬麗, 等. 計(jì)算機(jī)模擬HsRAD51蛋白與多肽BRC4分子對(duì)接[J]. 化學(xué)研究, 2016, 27(1): 97-101. DOI:10.14002/j.hxya.2016.01.017.

[19]鄭春松, 葉蕻芝, 許惠鳳, 等. 分子對(duì)接法預(yù)測(cè)獨(dú)活寄生湯對(duì)TNF-α和IL-1β作用的活性成分[J]. 福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 22(4): 28-30. DOI:10.3969/j.issn.1004-5627.2012.04.009.

[20]胡流芳, 王迎, 任汝靜, 等. Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路的抗氧化應(yīng)激作用及其調(diào)控機(jī)制[J]. 國(guó)際藥學(xué)研究雜志, 2016, 43(1): 146-152.DOI:10.3969/j.issn.1004-5627.2012.04.009.

[21]OUYANG H, STANFIELD J, COLE C, et al. High-SPF sunscreens may provide ultraviolet protection above minimal recommended levels by adequately compensating for lower sunscreen user application amounts[J]. American Academy Dermatology, 2012, 67(2): 1220-1227. DOI:10.1016/j.jaad.2012.02.029.

[22]SENARATNE L S, PARK P J, KIM S K. Isolation and characterization of collagen from brown backed toadfish (Lagocephalus gloveri)skin[J]. Bioresource Technology, 2006, 97(2): 191-197.

[23]張達(dá)江, 王亮. I型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其應(yīng)用研究的現(xiàn)狀與前景[J]. 生物技術(shù)通訊, 2006, 17(2): 265-269.

[24]呂玲玲, 金香淑, 施溯筠. 林蛙皮膠原蛋白的提取及抗氧化性[J]. 食品研究與開發(fā), 2013, 34(10): 20-22. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2013.10.006.

[25]竇梅, 初曉, 張杰, 等. 扇貝多肽保護(hù)單次UVA氧化損傷HaCaT細(xì)胞[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2006, 22(4): 416-420. DOI:10.3321/j.issn:1001-1978.2006.04.008.

[26]程若城, 李澄, 王清, 等. 雌二醇拮抗紫外線所致大鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞損傷作用的研究[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2009, 29(14): 1773-1775.DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2009.14.021.

[27]MILLER A F. Superoxide dismutase: active sites that save, but a protein that kills[J]. Current Opinion Chemistry Biology, 2004, 8(2):162-168. DOI:10.1016/j.cbpa.2004.02.011.

[28]王詠梅. 自由基與谷胱甘肽過氧化物酶[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào), 2005,21(5): 369-371. DOI:10.3969/j.issn.1008-9926.2005.05.017.

[29]劉娜, 劉俊田. 失巢凋亡在As斑塊破裂中的作用及機(jī)制[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2007, 23(3): 298-301. DOI:10.3321/j.issn:1001-1978.2007.03.006.

[30]吳偉, 徐蔚. 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)信息, 2011, 24(3): 1753-1754. DOI:10.3321/j.issn:1001-1978.2007.03.006.