楊小慧，石光波，拜曉彬，趙晨煊，李博生*

（1.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083；2.北京林業(yè)大學 林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083；3.北京林業(yè)大學螺旋藻研究所，北京 100083）

文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge）又名文燈果、山木瓜、僧燈木道等[1]，隸屬無患子科文冠果屬，廣泛分布在內(nèi)蒙、陜西、山西等14 個省市[2]，是我國特有的珍稀木本油料作物[3]。因其籽油[4]、種仁[5-6]、種皮[7-8]、果殼[9-12]中含有大量生物活性物質而被廣泛應用于醫(yī)藥和食品行業(yè)[13]。然而文冠果在實際生產(chǎn)中存在很多問題，其中之一便是幼果期落果嚴重，座果率很低，有“千花一果”之稱[14]；丁明秀等[15]曾發(fā)現(xiàn)赤峰地區(qū)翁牛特旗文冠果的落果率高達72.3%，可見文冠果落果資源十分豐富，然而目前有關文冠果落果成分和功效的科學研究報道極少。

黃酮類物質具有降血糖、抑菌[16]、抗腫瘤[17]、抗癌[18-19]、抗氧化[20]、調節(jié)免疫能力及治療糖尿病[21-22]等多種生理功能，目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9 000多種黃酮類物質[23]，其中研究較多的有槲皮素、山柰酚等[24-26]。目前關于文冠果黃酮類化合物的研究多局限于其成熟果實的果殼和種皮，而對于文冠果落果黃酮的單體成分研究鮮見報道。本實驗采用紫外分光光度法檢測到文冠果落果中含有生物活性物質黃酮，應用顯色反應、傅里葉變換紅外光譜和高效液相色譜相結合的方法對文冠果落果中黃酮的單體物質進行檢測分析，并比較文冠果落果黃酮對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性。本實驗將為文冠果落果的開發(fā)利用提供科學依據(jù)，推動文冠果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

文冠果落果、文冠果中期果實（生長期為30 d）、文冠果成熟果實（生長期為60 d）由內(nèi)蒙古赤峰市林業(yè)科學研究院苗圃提供；槲皮苷標準品、蘆丁標準品上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純） 美國Tedia公司；HPD-400型大孔樹脂北京科百奧生物技術有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 北京林業(yè)大學生物科學與技術學院微生物實驗室。

722型分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器公司；RE-2000A型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；1730型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Perkin-Elmer公司；LC-2010AHT型液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 文冠果落果及不同發(fā)育階段果實中黃酮含量的比較

1.2.1.1 文冠果黃酮提取液制備

將干燥后的文冠果落果、中期果皮、中期種子和成熟果皮分別粉碎后過60 目篩。按料液比1∶40（g/mL）加入體積分數(shù)40%乙醇溶液，70 ℃熱回流4 h，對文冠果落果和不同發(fā)育階段果實的黃酮物質進行浸提，進行3 次平行實驗以減小實驗誤差。

1.2.1.2 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱取10 mg蘆丁標準品，置于100 mL容量瓶中，去離子水定容，配成質量濃度為0.1 mg/mL蘆丁標準溶液。分別取0.2、0.6、1.0、1.5、2.0 mL蘆丁標準溶液，加入0.3 mL質量分數(shù)5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min。加入0.3 mL質量分數(shù)10%的氯化鋁溶液，搖勻后靜置6 min。加入2.0 mL質量分數(shù)4%的氫氧化鈉溶液，定容至10 mL，搖勻后靜置15 min。在波長510 nm處測其吸光度。以蘆丁質量濃度為橫坐標，溶液吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.1.3 氯化鋁比色法測黃酮含量

取2 mL經(jīng)稀釋的文冠果落果黃酮粗液加入0.3 mL質量分數(shù)5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min。加入0.3 mL質量分數(shù)10%的氯化鋁溶液，搖勻后靜置6 min。加入2.0 mL質量分數(shù)4%的氫氧化鈉溶液，定容至10 mL，搖勻后靜置15 min。在波長510 nm處測其吸光度，并依據(jù)蘆丁標準曲線計算黃酮含量。

1.2.2 文冠果落果黃酮的單體成分分析

1.2.2.1 文冠果落果黃酮的純化

準確稱取文冠果落果粉末300 g放入500 mL的三頸燒瓶中，按料液比1∶50（g/mL）加入體積分數(shù)50%乙醇溶液，85 ℃水浴回流提取3 h，將提取液4 000 r/min離心15 min后將濾液在40 ℃條件下旋轉蒸發(fā)濃縮后烘干，加少量去離子水溶解制備文冠果落果黃酮原液。將預處理好的HPD-400型大孔樹脂濕法裝柱，層析柱規(guī)格為20 cm×φ10 mm，加入20 mL質量濃度為2.64 mg/mL文冠果落果黃酮原液，調節(jié)pH值為3.0，上樣流速為2 BV/h，以同樣流速用2 BV去離子水清洗除雜，再用4 BV體積分數(shù)40%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，在40 ℃條件下蒸發(fā)濃縮干燥，得到純化的文冠果落果黃酮粉末。

1.2.2.2 文冠果落果黃酮顯色反應

鹽酸-鎂粉顯色反應：取純化后的文冠果落果黃酮少許用乙醇溶液溶解，取3 mL該溶液于試管中，設置乙醇溶液空白對照組，加入少許鎂粉，振蕩搖勻后加入5 滴鹽酸，沸水浴加熱2 min后觀察顏色變化。

氯化鐵顯色反應：取純化后的文冠果落果黃酮少許用水溶解后，取3 mL該溶液于試管中，加1 mL質量濃度10 mg/mL的氯化鐵-乙醇溶液，觀察顏色變化。

氫氧化鈉顯色反應：取純化后的文冠果落果黃酮少許用水溶解后，取3 mL該溶液于試管中，加入2%的氫氧化鈉溶液，觀察顏色變化。

1.2.2.3 文冠果落果黃酮紅外光譜分析

取HPD-400型大孔樹脂純化后的文冠果落果黃酮少許烘干，混合一定量的溴化鉀粉末，壓片制成固體，用傅里葉變換紅外光譜儀在掃描范圍為4 000～400 cm－1、分辨率為4 cm－1條件下平行掃描3 次，繪制文冠果落果黃酮傅里葉變換紅外光譜圖，再用上述相同的處理方法繪制標準品蘆丁的紅外光譜圖，進行對比分析鑒定。

1.2.2.4 文冠果落果黃酮高效液相色譜分析

色譜條件：色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；采用乙腈-0.2%甲酸溶液為流動相進行梯度洗脫，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量20 μL，設置340、365 nm雙波長同時檢測。梯度洗脫程序：0～5 min，5%乙腈；5～15 min，乙腈由5%增加到15%；15～35 min，乙腈由15%增加到18%；35～42 min，乙腈由18%增加到25%；42～45 min，乙腈由25%減少到5%；45～90 min清洗色譜柱。蘆丁、槲皮苷及其他被檢測物質要求達到與基線分離，最低理論塔板數(shù)為3 000。

蘆丁標準曲線的繪制：精密稱取5 mg蘆丁標準品用去離子水配制質量濃度為50 μg/mL的蘆丁標準品溶液，用微量注射器分別準確吸取5、10、15、20、25 μL的蘆丁標準品溶液，加去離子水配制成相同的體積，稀釋成各個梯度的溶液，注入液相色譜儀。然后分別測量各個色譜的峰面積，以峰面積為縱坐標，標準蘆丁質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

標準溶液高效液相色譜分析：分別精密稱取槲皮苷標準品和蘆丁標準品各5.0 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解配制成0.05 mg/mL的槲皮苷標準溶液和蘆丁標準溶液，各精密稱取50 mL槲皮苷標準溶液和50 mL蘆丁標準溶液置于100 mL容量瓶中，混合均勻，過0.45 μm微孔濾膜，在365 nm和340 nm兩組波長處進行高效液相色譜分析。

樣品溶液高效液相色譜分析：準確稱取大孔樹脂純化后的文冠果落果黃酮凍干粉10 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解后低頻超聲處理10 min，使黃酮凍干粉完全溶解，冷卻后用甲醇定容，然后用0.45 μm濾膜除雜，在365 nm和340 nm兩組波長處進行高效液相色譜分析，通過測峰面積從標準曲線上查出相應于此面積的蘆丁含量。

1.2.3 文冠果落果黃酮的抑菌能力測定

1.2.3.1 培養(yǎng)基的配制

稱取3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，15 g瓊脂，5 g NaCl，1 000 mL水加入到2 L燒杯中，加熱溶解，分裝至三角瓶中密封滅菌備用。

1.2.3.2 細菌的活化和菌懸液的制備

將6 支滅菌試管、培養(yǎng)基置于超凈工作臺上，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，取部分培養(yǎng)基置于試管中，形成30°的斜面放置，等待培養(yǎng)基凝固。分別挑取3 環(huán)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的保藏菌體，在試管斜面培養(yǎng)基上劃線，每種菌平行接種2 支試管。將接種后的試管置于37 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24 h。依據(jù)徐鳳等[27]的實驗結果可知在波長600 nm處菌懸液OD值為0.1即為菌體濃度達到1×106～1×107個/mL。參照此數(shù)據(jù)進行菌懸液濃度的確定。取4 個裝有等量0.9%生理鹽水的三角瓶滅菌后置于超凈工作臺上，各挑取3 環(huán)經(jīng)培養(yǎng)活化菌接種溶于上述三角瓶中，振蕩搖勻，于波長600 nm處測其OD值，確保OD值達到0.1。

1.2.3.3 抑菌實驗

將無菌培養(yǎng)基加熱融化后置于超凈工作臺中冷卻到50 ℃左右，按15～20 mL每平皿的量加入培養(yǎng)基制成培養(yǎng)基平板。待培養(yǎng)基平板凝固后編號，冷卻后加入各菌懸液0.1 mL，用涂布棒涂布均勻。用滅菌的不銹鋼打孔器在平板上打孔，孔徑7 mm。將0.1 mL質量濃度梯度為0.5、1、5、10、15、20 mg/mL的經(jīng)生理鹽水溶解的文冠果落果黃酮溶液加入各孔，將生理鹽水作為陰性對照。所有實驗平行重復3 次，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察統(tǒng)計抑菌圈大小，并評價其抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 文冠果落果及不同發(fā)育時期果實各部分黃酮含量比較

圖1 文冠果落果及不同發(fā)育時期果實各部分黃酮含量比較Fig. 1 Comparison of flavonoids content between X. sorbifolia fruit drop and different fruit parts at different developmental stages

由圖1可知，文冠果中期種子黃酮含量最高，其次為文冠果落果中黃酮含量為18.4 mg/g，中期果皮與成熟果皮中黃酮含量差異較小，本實驗選用的文冠果落果和不同發(fā)育時期的果實在發(fā)育過程中，文冠果落果黃酮含量較高，發(fā)育中期時黃酮集中積累于種子中，整個發(fā)育過程中果皮部分黃酮積累量較小。這種現(xiàn)象是否普遍存在于文冠果中需要更多的實驗進行證實。

2.2 文冠果落果黃酮的單體成分分析

2.2.1 文冠果落果黃酮顯色反應

表1 文冠果落果黃酮不同顯色反應結果Table 1 Results of color reaction of flavonoidss from X. sorbifolia fruit drop

文冠果落果黃酮在鹽酸-鎂粉、氫氧化鈉、氯化鐵三項顯色測試實驗中均成陽性反應，見表1。鹽酸-鎂粉顯色反應中出現(xiàn)磚紅色沉淀，說明文冠果落果黃酮中可能含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇中的一種或多種；氫氧化鈉顯色反應中出現(xiàn)橙色和黃褐色，說明落果黃酮中含有黃酮醇、二氫黃酮類和查耳酮中的一種或多種，因為在堿性溶液中二氫黃酮類可轉變?yōu)椴槎惢衔锸谷芤撼尸F(xiàn)橙色到黃色的顏色變化，黃酮醇類化合物會使溶液呈現(xiàn)黃色到棕色的顏色變化；氯化鐵顯色反應中溶液中出現(xiàn)墨綠色沉淀，說明有氫鍵締合的酚羥基存在，因為一般情況下氯化鐵溶液與多數(shù)黃酮類化合物生成黃綠等色的絡合物僅在有氫鍵締合的酚羥基存在時才會出現(xiàn)，說明文冠果落果中一定含有黃酮醇。綜合3 種顯色反應結果，可以得出結論即文冠果落果黃酮中一定含有黃酮醇，可能含有黃酮、查耳酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇中的一種或多種。

初步推測文冠果落果中含有芹菜素、黃芩素、野黃芩素、白楊素、漢黃芩素等黃酮單體；蘆丁、木犀草素、槲皮素、高良姜黃素、山柰酚、槲皮苷、漆黃素、楊梅黃酮、鼠李素、異鼠李素等黃酮醇單體；橙皮素、柚皮素、甘草素等二氫黃酮單體。

2.2.2 文冠果落果黃酮紅外光譜分析

圖2 文冠果落果黃酮（A）和蘆?。˙）紅外光譜掃描圖Fig. 2 Infrared spectra of flavonoids (A) and rutin (B) from Xanthoceras sorbifolia Bunge fruit drop

當樣品處于頻率連續(xù)變化的紅外線輻照時，其分子吸收了某些頻率的光波，獲得能量后分子產(chǎn)生振動或由基態(tài)向激發(fā)態(tài)進行能級躍遷，使得被吸收波段的透射光強度減弱，從而進行對應官能團分析，紅外光譜掃描結果見圖2。由圖2A可以看出，在3 000～400 cm－1范圍內(nèi)有多個明顯的吸收峰值?？芍墓诠涔S酮的單體物質中含有以下官能團：C＝C（1 607.10、1 514.04、1 536.83、1 443.77 cm－1）、C＝O（1 198.77 cm－1）、C—O—C（1 063.92 cm－1）、Ar—OH（733.46 cm－1）、—CH3（1 143.69、879.70 cm－1）、—CH2（298.96、2 856.79 cm－1）、—RNH（1 043.53、820.82 cm－1）[28]。初步推測文冠果落果黃酮含有蘆丁、漢黃芩素、異鼠李素、橙皮素等含—CH3的黃酮單體以及蘆丁、葛根素等含—CH2的黃酮單體。

對比圖2A、B可知，實驗用蘆丁標準品純度高，振動吸收峰形呈尖峰，特征明顯，而文冠果落果黃酮是混合物，振動吸收峰形受多種結構影響，特征性略差[29]。蘆丁和文冠果落果黃酮的吸收峰在1 597.61、1 572～1 501、1 455.16、1 360.20、1 058.23、877.80 cm－1六處重合或接近，說明在這些位置有相同的官能團結構，由此初步判定文冠果落果黃酮中可能具有蘆丁單體。為了進一步驗證文冠果落果黃酮中是否有蘆丁單體的存在，實驗采用高效液相色譜法對文冠果落果黃酮單體的成分進行了定性和定量分析。

2.2.3 文冠果落果黃酮高效液相色譜分析結果

圖3 蘆丁、槲皮苷混合對照標準品365 nm（A）和340 nm（B）HPLC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of rutin and quercetrin at 365 nm (A)and 340 nm (B)

由圖3可以看出，蘆丁在波長365 nm與340 nm處的檢測信號強度無差異，槲皮苷在波長340 nm處的檢測信號強度明顯高于365 nm處；從圖4可以看出，文冠果落果黃酮在38.35 min處的檢測信號峰與混合對照標準品中蘆丁的出峰時間相同，由此確定文冠果落果黃酮中含有蘆丁單體，而在18.22 min處無槲皮苷單體被檢測出來。除了蘆丁之外，文冠果落果黃酮在波長365 nm與340 nm處還有其他14 種單體物質被檢測出來，其中在28.57 min處檢測出的尖峰信號強度高于蘆丁單體，該化合物的結構和生理活性有待進一步研究。

圖4 文冠果落果黃酮于365 nm（A）和340 nm（B）HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatograms of flavonoids from X. sorbifolia fruit drop at 365 nm (A) and 340 nm (B)

由蘆丁標準曲線繪制得出進樣體積（X）與峰面積（Y）的線性回歸方程：Y=58 954X－5 550.8（R2=1）。結合蘆丁標準曲線通過計算得出樣品中蘆丁單體的含量為27 mg/g。有研究表明經(jīng)純化后的文冠果落果中總黃酮含量可達458 mg/g[30]，可知實驗用樣品中蘆丁質量分數(shù)約為6%。

2.3 文冠果落果黃酮抑菌作用效果

表2 文冠果落果黃酮質量濃度對菌種抑菌圈直徑的影響Table 2 Antibacterial effect of flavonoids from X. sorbifolia fruit drop mm

由表2可知，文冠果落果黃酮對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌抑制效果不同。按敏感程度評價標準分析，對大腸桿菌抑制效果最佳，黃酮質量濃度為15～20 mg/mL時，大腸桿菌對其高敏感（抑菌圈直徑15～20 mm），黃酮質量濃度為0.5～10 mg/mL時，大腸桿菌對其中敏感（抑菌圈直徑10～14 mm）；枯草芽孢桿菌在測試范圍內(nèi)對其中敏感（抑菌圈直徑10～14 mm）；黃酮質量濃度為15～20 mg/mL時，金黃色葡萄球菌對其中敏感（抑菌圈直徑10～14 mm），文冠果落果黃酮的抑菌效果為大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌。有研究表明當黃酮質量濃度同為1 mg/mL時，對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌而言，苦瓜黃酮的抑菌活性要小于文冠果落果黃酮的抑菌活性，而對金黃色葡萄球菌而言，苦瓜黃酮的抑菌活性要大于文冠果落果黃酮的抑菌活性，說明黃酮的抑菌活性除了與抑菌機理有關外，還可能與組成黃酮的單體成分有關。

3 討論與結論

文冠果落果中黃酮含量豐富，作為同樣富含黃酮的銀杏現(xiàn)在已開發(fā)出一系列銀杏化妝品，例如銀杏護膚水、銀杏潔面乳等，因此，作為一種極具潛力的提取黃酮類物質的資源，以文冠果落果為原料探索新型的應用領域，加大其在保健食品、醫(yī)學及工業(yè)用品領域的研究力度，促進文冠果落果制品的開發(fā)研究，對提高文冠果落果資源的綜合經(jīng)濟效益具有重要意義。

文冠果落果黃酮中蘆丁含量為27 mg/g，占文冠果落果總黃酮的6%左右，不存在槲皮苷單體。除蘆丁外，文冠果落果黃酮中還檢測到其他14 種未知的單體物質，經(jīng)顯色反應分析和傅里葉變換紅外光譜分析初步推測可能含有漢黃芩素、異鼠李素、橙皮素、葛根素，其中異鼠李素有止咳祛痰、活血散瘀等重要藥理作用；橙皮素有健胃、利尿、抗病毒和止胃痛的功效，所以對文冠果落果黃酮單體成分的進一步研究是十分必要的。

文冠果落果黃酮對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用，說明文冠果落果黃酮具有明顯的抑菌活性。與苦瓜黃酮相比文冠果落果黃酮抑菌效果更好，說明文冠果落果的抑菌活性除了與抑菌機理、菌種本身的細胞結構有關外，還可能與組成文冠果落果黃酮類物質的單體成分有關，所以本實驗中對于文冠果落果黃酮單體的研究也顯得尤為重要，我國西北地區(qū)文冠果落果資源豐富，后續(xù)將開展其抗菌活性成分的研究，為落果資源的充分利用提供理論基礎。

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