魏婷婷，趙良才，高紅昌

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；2.藥學(xué)院）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathies，DN）是糖尿病主要慢性并發(fā)癥之一，在糖尿病人群中發(fā)病率高，是引發(fā)終末期腎功能衰竭的主要原因[1]。其具體發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。目前，臨床上對DN的診斷主要依賴于對尿微量白蛋白排泄率的檢測，但該方法受肥胖、胰島素抵抗等諸多因素影響[2]。在蛋白尿和組織病理改變出現(xiàn)前，機(jī)體中一些代謝物和代謝途徑就已發(fā)生特征性改變，這些特征性的代謝變化很有可能就是DN發(fā)展演化過程中的潛在生物標(biāo)志物[3-4]。因此，從代謝角度了解DN的發(fā)病機(jī)制對其預(yù)測、診斷和治療起到關(guān)鍵性作用。基于核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）的代謝組學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于疾病的早期診斷、發(fā)病機(jī)制、藥物研究等。本研究通過1H NMR的代謝組學(xué)方法探索db/db小鼠血清代謝物的改變和相關(guān)代謝途徑，以期尋找DN相關(guān)的生物標(biāo)記物。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡的雄性DN模型db/db小鼠8只，體質(zhì)量為50～70 g；雄性C57BL/6J野生型小鼠9只，體質(zhì)量為20～30 g，購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2010-0150。

1.2 試劑與儀器 三甲硅烷基丙磺酸鈉（TSP）購自美國Sigma公司；D2O（99.9%氘代）購于英國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；血糖試紙及血糖儀（德國貝朗醫(yī)療國際貿(mào)易有限公司）；Bruker AVANCE III 600 MHz NMR波譜儀（德國Bruker公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集：小鼠飼養(yǎng)至17周時(shí)，用小鼠代謝籠收集db/db小鼠與野生型小鼠的尿液。接尿前12 h和接尿過程中嚴(yán)格禁食，并且在接尿管內(nèi)加50 μL 1%疊氮化鈉作為防腐劑，置于冰中接尿使其保持低溫。收集完畢，低溫離心（3 000 r/min，4 ℃，10 min），取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。尿液收集后進(jìn)行眼眶取血，血液靜置30 min后離心（3 000×g，4 ℃，15 min），取上清液用于1H NMR檢測，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 生化指標(biāo)檢測：采用血糖儀檢測小鼠尾靜脈的血糖值，采用全自動(dòng)生化分析儀（MINDRAY BS-300）檢測小鼠尿液中的生化指標(biāo)，包括尿肌酐（urine creatinine，UCr）、尿白蛋白肌酐比（uri

nary albumin to creatinine ratio，UACR），具體操作按試劑盒要求進(jìn)行。

1.3.3 血清的1H NMR檢測：將150 μL解凍的血清與300 μL的磷酸緩沖液（0.2 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.4）混合，并加入50 μL D2O用于鎖場。采用一維CPMG脈沖序列在298 K溫度下采集血清1H NMR譜。譜寬12 000 Hz，弛豫延遲4 s，數(shù)據(jù)采集點(diǎn)數(shù)32 K，累加64次，F(xiàn)ID充零至64 K后，加窗函數(shù)進(jìn)行傅立葉變換。對所有1H NMR譜進(jìn)行相位校正和基線調(diào)整，并以乳酸的甲基峰定標(biāo)（CH3，δ1.33）。

1.3.41H NMR波譜數(shù)據(jù)處理和模式分析：將1H NMR譜進(jìn)行自動(dòng)分段積分，分別進(jìn)行偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analys，PLS-DA）和定量分析。為了消除飽和水峰時(shí)引起的譜線扭曲，除去預(yù)飽和壓水峰后的殘留水峰區(qū)。由于譜圖中葡萄糖峰非常顯著，因此需去除此峰，否則其高濃度會(huì)影響到后面的分析結(jié)果[5]。為了補(bǔ)償樣本間的濃度差異，對每段積分值都相對于該譜的所有積分值進(jìn)行歸一化處理。將歸一化后得到的積分值導(dǎo)入SIMCA-P+ 12.0軟件包（瑞典Umetrics公司）進(jìn)行PLS-DA。PLS-DA的第一主成分（principal component1，PC1）和第二主成分（principal component2，PC2）可以代表矩陣中最大的信息變量，其構(gòu)建的得分圖上的每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本的代謝模式；相應(yīng)的載荷圖反映積分區(qū)間對分組的貢獻(xiàn)[6-7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。UACR、UCr與血清1H NMR檢測的多種代謝物間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠生化指標(biāo)比較db/db小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中體質(zhì)量均超過野生型小鼠的2倍，呈明顯的肥胖狀態(tài)；從生化指標(biāo)來看，db/db小鼠的血糖、UACR均超過野生型小鼠的2倍，而UCr則顯著降低，不足野生型小鼠的1/5。這一變化表明db/db小鼠呈現(xiàn)出典型的糖尿病癥狀，且存在一定的腎損傷。

2.2 血清1H NMR譜結(jié)果 通過1H NMR譜可以同時(shí)獲得許多小分子代謝物信息，其代謝物歸屬為：低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白（LDL/VLDL，δ0.85），異亮氨酸/亮氨酸（isoleucine/leucine，I/LEU，δ0.95），3-羥基丁酸（3-hydroxybutyrate，3-HB，δ1.19），乳酸（lac-tate，LAC，δ1.33，δ4.10），丙氨酸（alanine，ALA，δ1.47），乙酸（acetate，ACE，δ1.91），乙酰乙酸（acetoacetate，ACA，δ2.27），丙酮酸（pyruvate，PYU，δ2.36），谷氨酰胺（glutamine，GLI，δ2.46），檸檬酸（citrate，CIT，δ2.52），肌酸（creatine，CRE，δ3.03），膽堿（choline，CHO，δ3.19），甘氨酸（glycine，GLY，δ3.55），甘油（glycerol，GLL，δ3.65），β-葡萄糖（β-glucose，β-GLU，δ4.65），α-葡萄糖（α-glucose，α-GLU，δ5.24），酪氨酸（tyrosine，TYR，δ6.89），組氨酸（histidine，HIS，δ7.07），苯丙氨酸（phenylalanine，PHE，δ7.39）和甲酸（for-mate，F(xiàn)OR，δ8.45）。見圖1。

圖1 2組小鼠血清典型的1H NMR譜

2.3 PLS-DA結(jié)果db/db小鼠和野生型小鼠的血清代謝模式在第一主成分上明顯分開（見圖2A），對應(yīng)的模式置換圖也顯示所建立的PLS-DA模型是可行的（見圖2B）。從相應(yīng)的載荷圖中可以看出LDL/VLDL、3-HB、LAC、ACA、PYU、GLI、CRE、CHO、TYR、HIS和PHE對2組的區(qū)分有較大的貢獻(xiàn)（見圖2C）。

2.4 代謝物定量分析 與野生型小鼠比，db/db小鼠血清中葡萄糖代謝相關(guān)的代謝物PYU、LAC、CIT降低，脂質(zhì)代謝相關(guān)代謝物L(fēng)DL/VLDL水平升高，3-HB和ACA水平降低，氨基酸代謝中，I/LEU水平升高，GLY、GLI、TYR和PHE水平降低，CRE和CHO水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.5 相關(guān)性分析 選擇了2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物與UCr和UACR進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，僅在db/db小鼠中，血清CHO與UACR呈正相關(guān)（r=0.717，P＜0.05），GLI與UCr呈負(fù)相關(guān)（r=-0.737，P＜0.05）。見圖4。

3 討論

DN是臨床常見的糖尿病并發(fā)癥，其發(fā)病率高，是糖尿病致殘致死的主要原因之一[8]。由于缺乏早期的臨床特征，很多糖尿病患者無法得到有效的治療，很快出現(xiàn)間隙蛋白尿，進(jìn)而出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫和高血壓等癥狀，發(fā)生腎功能不全，出現(xiàn)尿毒癥和腎衰竭，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康。db/db小鼠是由于4號(hào)染色體的瘦素受體基因發(fā)生突變所致的先天性肥胖的2型糖尿病模型，其糖尿病病程與人極為相似，是研究DN的理想模型[9]。

UACR是目前公認(rèn)的腎臟損傷和功能障礙的標(biāo)志物，也是臨床上診斷早期DN的一項(xiàng)敏感而可靠的指標(biāo)[10]。在17周時(shí)，db/db小鼠除了血糖這項(xiàng)經(jīng)典的糖尿病指征升高外，其UACR升高，UCR降低，說明其存在一定的腎損傷，且本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)第17周db/db小鼠的腎組織出現(xiàn)彌漫性系膜基質(zhì)擴(kuò)張，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚等腎臟病理變化[11]，表明其已經(jīng)出現(xiàn)DN。

圖2 2組小鼠血清1H NMR圖譜的PLS-DA分析結(jié)果

圖3 2組小鼠血清代謝物比較

圖4 db/db小鼠血清代謝物的相關(guān)性分析

1H NMR檢測能同時(shí)獲得大量小分子代謝物信息，本研究中獲得的代謝物歸屬都基于我們前期的研究成果[12-13]，并且經(jīng)過2D1H-1H COSY和TOCSY譜圖驗(yàn)證。運(yùn)用基于1H NMR的代謝組學(xué)結(jié)合相關(guān)性分析來探究db/db小鼠血清中的整體代謝改變，尋找與DN發(fā)生發(fā)展相關(guān)的代謝變化以及特定代謝調(diào)控途徑，分析DN潛在的生物標(biāo)志物，從代謝角度來推測DN的發(fā)病機(jī)制，為DN預(yù)測、診斷和治療提供有價(jià)值的依據(jù)。我們發(fā)現(xiàn)db/db小鼠和野生型小鼠的血清代謝模式截然不同，并且篩選出了一系列對2組小鼠血清代謝模式區(qū)分貢獻(xiàn)較大的小分子代謝物。

葡萄糖代謝是維持機(jī)體生命活動(dòng)能量的主要來源，包括葡萄糖有氧氧化和糖酵解。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，db/db小鼠血清中三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物CIT下調(diào)，糖酵解的相關(guān)產(chǎn)物PYU和LAC也下調(diào)，表明這2個(gè)途徑均受到不同程度的抑制，這與STZ誘導(dǎo)的糖尿病SD大鼠的血清代謝輪廓[12]和DN GK鼠的結(jié)果相似[13]?？赡苁怯捎?型糖尿病存在胰島素抵抗，葡萄糖通過這2個(gè)途徑進(jìn)行分解供能的代謝途徑存在障礙，造成這2個(gè)代謝途徑紊亂。

DN存在一定的脂類代謝紊亂，血脂異常會(huì)加速腎臟病的進(jìn)展，其與腎功能迅速下降及進(jìn)展至需要腎臟替代治療密切相關(guān)[14]。血脂水平越高，脂質(zhì)就越容易在腎小球中沉積，腎小球的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞吞噬脂質(zhì)，會(huì)形成泡沫細(xì)胞，使腎小球的硬化程度加重，進(jìn)而加重蛋白尿[15]。本研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠血清中LDL/VLDL水平顯著高于野生型小鼠，DN的進(jìn)展可能與血脂代謝異常有關(guān)。ACA和3-HB是酮體的主要成分，也是肝內(nèi)線粒體脂肪酸β氧化的中間產(chǎn)物[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，db/db小鼠血清中ACA與3-HB水平顯著下降，表明在DN發(fā)生發(fā)展過程中脂肪酸β氧化代謝途徑可能發(fā)生了紊亂。這與王旭方等[17]發(fā)現(xiàn)的DN患者脂肪酸β氧化障礙結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)CHO與UACR呈正相關(guān)（r=0.717，P＜0.05），可能與DN腎損傷存在一定的相關(guān)性，可能是DN的潛在生物標(biāo)記物。CHO可通過二甲基甘氨酸轉(zhuǎn)化為肌酐，肌酐與腎功能密切相關(guān)；CHO也可被腸道微生物群分解成甲胺、二甲胺、三甲胺和氧化三甲胺，該類代謝物是體內(nèi)重要的滲透壓調(diào)節(jié)劑[18-19]。有多項(xiàng)研究表明三甲胺和氧化三甲胺是慢性腎病腎損傷的潛在生物標(biāo)記物[20-21]。

本研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠血清中GLI、GLY、TYR和HIS降低，說明糖尿病狀態(tài)下糖異生作用增強(qiáng)，這些氨基酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖途徑加強(qiáng)。作為血清中最為豐富的氨基酸，GLI是最重要的糖異生前體氨基酸，增加葡萄糖的生成[22]。有研究表明GLI能夠改善胰島素抵抗[23]，并能夠減輕膿毒癥引起的急性腎小管損傷[24]，在相關(guān)性分析中，GLI與UCr呈負(fù)相關(guān)（r=-0.737，P＜0.05），GLI可能也參與了DN。CRE能轉(zhuǎn)化為肌酐，而肌酐是評(píng)價(jià)腎小球率過濾的指標(biāo)，db/db小鼠血清中CRE下降，這可能與腎損傷引起血肌酐上升有關(guān)[25]。db/db小鼠血清中I/LEU升高，I/LEU是支鏈氨基酸，與其他氨基酸的代謝模式不同，是輔助合成肌肉的氨基酸[26]。本研究結(jié)果中I/LEU與UACR沒有相關(guān)性，但是其是血清中含量升高的氨基酸，有研究表明其可以作為預(yù)測糖尿病胰島素抵抗相關(guān)的生物標(biāo)記物[27]。

綜上所述，本研究運(yùn)用基于1H NMR的代謝組學(xué)探究了db/db小鼠和野生型小鼠血清的代謝模式，發(fā)現(xiàn)2種小鼠血清的代謝模式截然不同，在DN發(fā)病過程中三羧酸循環(huán)、糖酵解途徑和脂類代謝途徑均受到不同程度抑制，糖異生作用增強(qiáng)，結(jié)合相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)CHO可能是與DN相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物。

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