譚子超，劉浩民，薛 梅，宋玉芹，王述柏*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.山東省海陽(yáng)市畜牧獸醫(yī)站，山東海陽(yáng) 265100）

飼用酶制劑不僅會(huì)促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，而且會(huì)影響腸道微生物的發(fā)育 （任文等，2017；NIBA 等，2009）。 周小娟等（2013）研究發(fā)現(xiàn)AA肉雞飼糧中添加復(fù)合酶可明顯降低盲腸大腸桿菌數(shù)量，提高乳酸桿菌數(shù)量。Choct等（2004）研究報(bào)道，小麥日糧添加木聚糖酶使雞腸道食糜黏度下降，微生物區(qū)系改變。由腸道菌群構(gòu)建的生物屏障可對(duì)外界及機(jī)體內(nèi)的病原微生物產(chǎn)生定植抗力，防止其侵入機(jī)體，保持健康（甄建華等，2017）。多年來(lái)飼用酶制劑研究主要集中在對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響，而對(duì)腸道微生物區(qū)系的影響及其相關(guān)作用機(jī)制的研究相對(duì)較少 （任文等，2017）。本試驗(yàn)研究了肉雞小麥-豆粕型飼糧添加不同水平復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞胃腸道微生物菌群和食糜酸度的影響，從而為其在肉雞小麥型飼糧中的合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與動(dòng)物 4種單酶制劑按復(fù)合酶酶譜劑量均勻混合，復(fù)合酶酶譜：木聚糖酶（850U/g）、纖維素酶（750 U/g）、β-葡聚糖酶（50 U/g）、植酸酶（2000 U/kg）（薛梅等，2015）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將1日齡健康A(chǔ)A肉雞720只（體重40 g左右）隨機(jī)分為6組（120只/組），每組設(shè)6個(gè)重復(fù)（20只/重復(fù)），1組（對(duì)照組）飼喂基礎(chǔ)飼糧，2～6組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加1000、1500、2000、2500、3 000 mg/kg 復(fù)合酶制劑。 試驗(yàn)分1～21 d和22～42 d兩個(gè)階段?；A(chǔ)飼糧參照AA肉雞營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制（表1）。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)雞的飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)雞采用三層半階梯式籠養(yǎng)，自由采食、飲水，按照白羽肉雞常規(guī)飼養(yǎng)管理規(guī)程飼養(yǎng)于同棟雞舍。

1.4 腸道不同部位內(nèi)容物微生物檢測(cè) 樣品采集與處理：在試驗(yàn)第21天和42天，從每個(gè)重復(fù)中選擇接近平均體重的肉雞1只，頸部放血處死，迅速打開(kāi)腹腔，分別結(jié)扎十二指腸、空腸、回腸和盲腸兩端，取下十二指腸、空腸、回腸和盲腸后，立即放入-20℃冰箱中保存。取低溫保存的十二指腸、空腸、回腸和盲腸自然解凍，在超凈工作臺(tái)中取內(nèi)容物，充分混勻后取0.5 g，加入到盛有4.5mL滅菌生理鹽水的離心管中，用微型振蕩器振蕩10min，此液為10-1倍稀釋液，離心后吸取上清液0.5mL，加入盛有4.5 mL滅菌生理鹽水的另一只離心管中進(jìn)行10-2倍稀釋，依次稀釋到10-7倍。

細(xì)菌培養(yǎng)：取稀釋液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，乳酸桿菌采用乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基（LBS）37℃厭氧培養(yǎng)48 h、雙歧桿菌采用雙歧桿菌培養(yǎng)基（BS）37℃厭氧培養(yǎng)48 h、大腸桿菌采用麥康凱培養(yǎng)基37℃有氧培養(yǎng)24 h、總需氧菌采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基37℃有氧培養(yǎng)24 h、總厭氧菌采用Schaedler厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48 h。每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。

菌落計(jì)數(shù)：選擇最適宜的稀釋梯度 （以0～300個(gè)菌落為宜），對(duì)細(xì)菌進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù)平均值，并計(jì)算每克腸道內(nèi)容物所含的細(xì)菌數(shù)。結(jié)果以每克內(nèi)容物中菌落數(shù)的常用對(duì)數(shù)表示（lg cfu/g）。

1.5 消化道不同部位食糜酸度檢測(cè) 在試驗(yàn)第21天和第42天，從每個(gè)重復(fù)中選擇接近平均體重的肉雞1只，頸部放血處死，迅速打開(kāi)腹腔，取出嗉囊、腺胃、肌胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）和盲腸食糜，立即用testo 205型pH計(jì)測(cè)其pH。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行初步整理，采用SPSS 17.0進(jìn)行ANOVO方差分析、Duncan法進(jìn)行組間多重比較。結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水平復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞腸道不同部位大腸桿菌數(shù)量的影響 21 d和42 d肉雞腸道各部位大腸桿菌數(shù)量隨復(fù)合酶制劑添加水平的增加呈不同程度下降趨勢(shì)（表2）。十二指腸和空腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)量各組間均差異不顯著 （P＞0.05）；21 d肉雞回腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)量，4～6組分別較 1組降低 0.94%、1.10%、1.41%（P＜0.05）。42 d肉雞回腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)量，3～6組分別較 1組降低 1.03%（P＜0.05）、1.33%（P＜0.05）、1.62%（P ＜ 0.01）、1.77%（P ＜ 0.01）；4 ～ 6組盲腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)量分別較1組降低0.83%（P ＜ 0.05）、1.11% （P ＜ 0.01）、1.11%（P ＜0.01）。各組雞腸道大腸桿菌數(shù)量存在部位的明顯差異，腸道前段至后段數(shù)量逐漸增多。

2.2 不同水平復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞腸道不同部位乳酸桿菌數(shù)量的影響 21 d和42 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物乳酸桿菌數(shù)量，2～6組均不同程度高于1組（表3）。21 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物乳酸桿菌數(shù)量，4～6組空腸分別較1組升高2.18%、2.47%、3.20%（P ＜ 0.05），2 ～ 6組盲腸分別較 1組升高 2.06%、3.22%、3.60%、3.47%、3.60%（P＜0.05）。42 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物乳酸桿菌數(shù)量，4～6組十二指腸分別較1組升高0.94% （P ＜ 0.05）、1.34% （P ＜ 0.01）、1.34% （P ＜0.01）；4～6組空腸分別較1組升高1.59%（P＜0.05）、1.74%（P ＜ 0.01）、2.03%（P ＜ 0.01）；4 ～ 6組盲腸分別較1組升高0.97%（P＜0.01）、1.09%（P ＜ 0.01）、1.09%（P ＜ 0.01）。

表2 復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞腸內(nèi)容物大腸桿菌的影響lg cfu/g

2.3 不同水平復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞腸道不同部位雙歧桿菌數(shù)量的影響 21 d和42 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物雙歧桿菌數(shù)量，2～6組均不同程度高于1組（表4）。21 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物雙歧桿菌數(shù)量，4～6組十二指腸分別較1組升高 3.28%、4.37%、4.74%（P ＜ 0.05），6組空腸較1組升高2.59%（P＜0.05）。42 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物雙歧桿菌數(shù)量，3～6組十二指腸分別較 1組升高 2.37%、2.92%、3.28%、3.65%（P＜0.05）；3～6組回腸分別較 1組升高 1.04%、1.34%、1.49%、1.64%（P＜0.05）；3～6組盲腸分別較 1組升高 0.63%、0.88%、1.13%、1.13%（P＜0.05）；6組空腸較 1組升高 1.78%（P ＜ 0.05）。

2.4 復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞腸道總需氧菌數(shù)量的影響 21 d和42 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物總需氧菌數(shù)量，2～6組均不同程度低于1組 （表5）。21 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物總需氧菌數(shù)量，5組、6組十二指腸分別較1組降低1.91%、2.07%（P＜0.05）；5組、6組盲腸分別較1組降低2.04%、2.99%（P＜0.05）。42 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物總需氧菌數(shù)量，4～6組十二指腸分別較1組降低1.47%、1.28%、1.65%（P＜0.05）；5～6組空腸分別較1組降低1.76%、1.76%（P＜0.05）；6組回腸較1組降低1.44%（P＜0.05）；3～6組盲腸分別較1組降低1.07%、2.28%、2.55%、2.82%（P ＜ 0.05）。

表3 復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞腸道內(nèi)容物乳酸桿菌的影響lg cfu/g

表4 復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞腸道內(nèi)容物雙歧桿菌的影響lg cfu/g

2.5 復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞腸道總厭氧菌數(shù)量的影響 21 d和42 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物總厭氧菌數(shù)量，2～6組均不同程度高于1組 （表6）。21 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物總厭氧菌數(shù)量，4～6組十二指腸分別較1組升高 0.96%、1.24%、1.37%（P＜0.05）；3～6組回腸分別較1組升高1.22%、2.03%、2.30%、2.71%（P ＜ 0.05）；3 ～ 6 組盲腸分別較 1組升高 0.99%、1.37%、1.86%、2.11%（P＜0.05）。42 d肉雞腸道不同部位內(nèi)容物總厭氧菌數(shù)量，4～6組十二指腸分別較1組升高0.79%、1.19%、1.32%（P＜0.05）；4～6組回腸分別較 1組升高 0.97%、1.39%、1.53%（P＜0.05）；4～6組盲腸分別較1組升高0.83%、1.07%、1.30%（P＜0.05）；5～6組空腸分別較 1組升高 1.41%、1.55%（P ＜ 0.05）。

2.6 不同水平復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞消化道食糜酸度的影響 21、42 d肉雞的嗉囊、腺胃、肌胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸食糜pH（表7）各試驗(yàn)組（2～6組）均低于對(duì)照組（1組），但差異均不顯著（P ＞ 0.05）。

3 討論

3.1 小麥-豆粕型飼糧中添加復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞腸道微生物的影響 有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌及致病菌大腸桿菌是動(dòng)物腸道的正常菌群。研究發(fā)現(xiàn)木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶以及β-甘露聚糖酶等NSP酶對(duì)胃腸道中有益菌有益生作用，而對(duì)有害菌具有抑制作用（任文等，2017；丁雪梅等，2009）。周利芬等（2004）研究報(bào)道，肉雞飼糧中添加酶制劑能促進(jìn)腸道乳酸菌的生長(zhǎng)，抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)；宋智娟等（2006）研究報(bào)道，β-葡聚糖酶的添加，促進(jìn)了乳酸桿菌、雙歧桿菌的生長(zhǎng)，抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，小麥-豆粕型飼糧中添加復(fù)合酶制劑，肉雞腸道各部位的大腸桿菌、總需氧菌數(shù)量有不同程度降低，而乳酸桿菌、雙歧桿菌、總厭氧菌數(shù)量呈明顯增加趨勢(shì)，本試驗(yàn)所用復(fù)合酶制劑有優(yōu)化肉雞腸道有益菌群的作用，與上述研究結(jié)果一致。但不同復(fù)合酶對(duì)腸道微生物的影響報(bào)道不盡一致，有部分研究發(fā)現(xiàn)飼用酶制劑對(duì)腸道微生物菌群影響不明顯（任文等，2017）。

表5 復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞腸道內(nèi)容物總需氧菌數(shù)量的影響lg cfu/g

表6 復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞腸道內(nèi)容物總厭氧菌的影響 lg cfu/g

表7 復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞消化道食糜pH的影響

3.2 小麥-豆粕型飼糧中添加復(fù)合酶制劑對(duì)肉雞消化道食糜酸度的影響 消化道微生物、腺胃分泌的鹽酸、胰液、膽汁及腸液等是消化道食糜酸度值的決定因素，pH降低可抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)乳酸桿菌、雙歧桿菌的增殖，而乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌又可將腸道中的可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)變成乳酸和醋酸，從而降低腸道環(huán)境的pH（Zacherl等，2011；Dikeman 等，2006）。 動(dòng)物胃腸道酸性環(huán)境有利于胃蛋白酶原的激活，pH越低，胃蛋白酶原激活率越高（冷向軍等，2001）。呂秋鳳等（2013）研究報(bào)道，小麥飼糧中添加木聚糖酶能夠顯著降低肉雞空腸食糜pH。本試驗(yàn)顯示添加不同水平復(fù)合酶制劑肉雞消化道各部位食糜酸度均低于對(duì)照組，但差異均不顯著。 Mathlouthi（2003）報(bào)道，小腸酸度值的下降是由木聚糖酶和β-葡聚糖酶降解NSP產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸造成的。Hume（1992）等研究表明，盲腸酸度值的下降是由于酶制劑提高了腸道內(nèi)乳酸菌和揮發(fā)性脂肪酸的濃度。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，肉雞小麥-豆粕型飼糧中添加不同水平復(fù)合酶制劑，可不同程度增加腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌、總厭氧菌的數(shù)量，降低大腸桿菌和總需氧菌的數(shù)量；不同水平復(fù)合酶制劑均有降低肉雞消化道各部位食糜酸度值趨勢(shì)，添加量以2000～3000mg/kg作用效果最佳。

參考文獻(xiàn)

[1]丁雪梅，張克英.小麥-豆粕型日糧添加木聚糖酶對(duì)艾維茵肉雞免疫指標(biāo)、腸道形態(tài)和微生物菌群的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2009，21（6）：931 ～ 937．

[2]冷向軍，李小勤，王康寧.pH值對(duì)胃蛋白酶原激活率影響的研究[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2001，20（1） ：27 ～ 30.

[3]呂秋鳳，文宗雪，邵彩梅，等.小麥日糧中添加木聚糖酶對(duì)肉雞腸道大腸桿菌數(shù)量、pH值及食糜黏度的影響 [J].飼料工業(yè)，2013，34（2）：41 ～ 44.

[4]任 文，喻曉瓊，翟恒孝，等.飼用酶制劑調(diào)節(jié)單胃動(dòng)物腸道微生態(tài)及作用機(jī)理[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2017，29（3）：762 ～ 768.

[5]宋智娟.β-葡聚糖酶對(duì)肉雞生產(chǎn)性能、腸道微生物及免疫機(jī)能的影響：[碩士學(xué)位論文][D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[6]薛梅，史雪萍，徐玉，等.肉雞小麥-豆粕型飼糧中4種單酶復(fù)配的體外消化篩選試驗(yàn)[J].中國(guó)畜牧雜志，2015，51（3）：57 ～ 62.

[7]甄建華，于河，谷曉紅.腸道微生態(tài)醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展概述[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（7）：3069 ～ 3078.

[8]周利芬.厭氧真菌粗酶制劑的研制及應(yīng)用研究：[碩士學(xué)位論文][D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[9]周小娟，常江，張志帥，等.復(fù)合酶對(duì)肉雞生產(chǎn)性能和腸道微生物的影響[J].中國(guó)飼料，2013，14：19 ～ 22.

[10]Choct M，Kocher A，W aters D L，et al.A comparison of three xylanaseson the nutritive value of two wheats for broiler chickens[J].British JournalofNutrition，2004，92：53 ～ 61.

[11]Dikeman C L，F(xiàn)ahey Jr G C.Viscosity as related to dietary fiber：a review[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2006，46（8）：649 ～ 663.

[12]Hume M F，Kubena L F，Beier R C，et al.Fermentation of[14C]lactose in broiler chicksby ceal anaerobes[J].Poultry Science，1992，71：1464 ～ 1470.

[13]Mathlouthi N，M allet S Saulnier L.Effects of xylanase and βglucanase addition on performance，nutrient digestibility，and physico-chem ical conditions in the small intestine contentsand caecalm icroflora of broiler chickens fed a wheat and barley-based diet[J].Journal of Animal Science，2003，51：395 ～ 406.

[14]Niba A T，Beal JD，Kudi A C，et al．Bacterial fermentation in the gastrointestinal tract of non-rum inants：influence of fermented feeds and fermentable carbohydrates[J].Tropical Animal Health and Production，2009，41（7） ：1393 ～ 1407.

[15]Zacherl C，Eisner P，Engel K H.In vitro model to correlate viscosity and bile acid-binging capacity of digested water-soluble and dietary fibres[J].Food Chemistry，2011，126（2）：423 ～ 428.