王仁虎，夏 楠，姜桂苗，陶永梅，劉憲斌 ，曲洪磊，劉桂芹，秦緒嶺，劉文強(qiáng)*

(1.聊城大學(xué)，山東聊城 252059；2.東阿阿膠股份有限公司,山東東阿 252200； 3.臨清市魏灣鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山東臨清 252600)

傳統(tǒng)的分散養(yǎng)殖模式效益低下，造成了我國(guó)毛驢存欄量逐年降低，不能滿(mǎn)足急劇增長(zhǎng)的阿膠生產(chǎn)、驢肉和驢奶等行業(yè)發(fā)展的需要。為此，近幾年出現(xiàn)的規(guī)模化養(yǎng)驢業(yè)得到了迅速發(fā)展，僅山東省就建立了超過(guò)200個(gè)規(guī)模化養(yǎng)驢場(chǎng)和扶貧驢場(chǎng)。這些畜牧場(chǎng)一旦出現(xiàn)傳染病的流行，將會(huì)給養(yǎng)驢產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)其處理和治療必然涉及到抗生素等藥物的使用和殘留，影響?zhàn)B殖安全，也進(jìn)而影響相關(guān)產(chǎn)品的品質(zhì)。而多種人獸共患傳染病一旦出現(xiàn)，將給阿膠生產(chǎn)、驢肉、驢奶等行業(yè)帶來(lái)直接而嚴(yán)重的食品藥品安全危機(jī)。目前,國(guó)內(nèi)外有關(guān)驢傳染病的發(fā)病規(guī)律、地域分布、診斷方法、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、預(yù)防控制和檢疫凈化措施等相關(guān)資料都需要進(jìn)行調(diào)查研究。理論上馬屬動(dòng)物疫病均可能在規(guī)?；B(yǎng)驢場(chǎng)發(fā)生和流行，多種動(dòng)物共患的疫病，特別是人獸共患傳染病也有可能在規(guī)?；B(yǎng)驢場(chǎng)造成感染。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，并結(jié)合我國(guó)其他畜種傳染病的防控經(jīng)驗(yàn)，在規(guī)?；B(yǎng)驢場(chǎng)有可能發(fā)生并造成嚴(yán)重威脅的傳染性疾病包括流感、沙門(mén)菌病、布魯菌病、皰疹病毒感染和日本腦炎等[1-5]。流感在驢群中發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性高，特別是集約化規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)的風(fēng)險(xiǎn)更大。人、豬與馬的流感病毒都是H3亞型，加之近3年禽流感H7N9亞型毒株流行嚴(yán)重，不排除發(fā)生種間傳播和病毒重組，產(chǎn)生新的變異毒株的可能，極易在規(guī)模養(yǎng)驢場(chǎng)流行[6-8]。日本腦炎引起發(fā)熱、神經(jīng)癥狀和流產(chǎn)等表現(xiàn)，馬屬動(dòng)物對(duì)日本腦炎易感性非常高，造成高熱稽留、流產(chǎn)和神經(jīng)癥狀等[5，9]。布魯菌病造成馬爾他熱、繁殖異常，引起嚴(yán)重的貿(mào)易限制，其易感動(dòng)物是羊、牛、豬和人等，國(guó)外也有驢群血清學(xué)調(diào)查的報(bào)道[10]。沙門(mén)菌引起敗血癥、腸炎、懷孕母驢流產(chǎn)，是動(dòng)物性食品中最重要的細(xì)菌控制指標(biāo)[11]。針對(duì)這些傳染病的抗原或抗體檢測(cè)應(yīng)用于驢場(chǎng)檢測(cè)，可以為傳染病的監(jiān)測(cè)凈化和養(yǎng)驢產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 驢場(chǎng)選擇 于2015年11月和2016年6月，分別于山東省聊城市7個(gè)縣區(qū)13個(gè)規(guī)模驢場(chǎng)，選擇存欄量在300頭～1 000頭之間的驢場(chǎng)采樣。

1.1.2 樣品采集 按照常規(guī)方法共采集血液、棉拭子和病料226份。其中血液樣品111份(健康驢45份、有呼吸道癥狀的驢66份)，用于檢測(cè)日本腦炎、布魯菌病、流感病毒；拭子樣品55份(健康驢30份、有呼吸道癥狀的驢25份)，用于檢測(cè)流感病毒；糞便樣品63份(新生死亡驢駒23份、有腹瀉癥狀的驢40份)，用于檢測(cè)沙門(mén)菌；采集流產(chǎn)死胎驢駒的肝臟病料7份用于檢測(cè)布魯菌病、日本腦炎、皰疹病毒和沙門(mén)菌。

1.1.3 主要試劑 PCR和反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)相關(guān)試劑，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；布魯菌病虎紅凝集試驗(yàn)診斷抗原，青島易邦生物工程有限公司產(chǎn)品；膠體金布魯菌病診斷試紙條和C-ELISA布魯菌病試劑盒，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；馬日本腦炎ELISA試劑盒，上海瓦蘭生物科技有限公司產(chǎn)品；沙門(mén)菌培養(yǎng)的中國(guó)藍(lán)培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基和血液瓊脂培養(yǎng)基等，山東鑫科生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 對(duì)血液樣品，靜置30 min后，以3 000 r/min離心15 min，取血清備用。糞便樣品取1 g加到9 mL滅菌生理鹽水中，充分混勻后吸取1 mL連續(xù)作10倍稀釋后備用。鼻咽拭子使用生理鹽水充分振蕩洗滌，然后12 000 r/min離心30 min，取上清液備用。流產(chǎn)死胎和新生驢駒死亡后采集糞便和肝臟樣品，用于分離沙門(mén)菌。

1.2.2 H3N8亞型流感病毒的血凝性檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè) 參考1.2.1所述方法，將鼻咽拭子樣品處理后接種10日齡SPF雞胚，72 h后取尿囊液進(jìn)行HA測(cè)定。使用Trizol試劑提取全血和拭子處理樣品的RNA，參照文獻(xiàn)[12]方法和HA、NA引物序列，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，并對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察。

1.2.3 馬皰疹病毒檢測(cè) 取流產(chǎn)死胎驢駒的肝臟病料，委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所參考前文所述的real-time PCR進(jìn)行鑒定。

1.2.4 布魯菌病的檢測(cè) 采用(競(jìng)爭(zhēng)抑制)膠體金試紙條、虎紅平板凝集試驗(yàn)和C-ELISA對(duì)血清樣品進(jìn)行了布魯菌病篩查。按照說(shuō)明書(shū)要求的程序進(jìn)行操作。布魯菌C-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，內(nèi)含抗原包被板、單克隆抗體4C3、陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、羊抗鼠酶標(biāo)抗體、羊抗鼠酶標(biāo)抗體稀釋液、樣品稀釋液、20倍洗滌液、底物顯示液、終止液、血清稀釋板等。

抑制率(PI)=(陰性對(duì)照OD 450 nm-檢測(cè)樣品OD 450 nm)/陰性對(duì)照OD 450 nm×100%

當(dāng)血清樣本的PI≥30%時(shí)，為布魯菌病抗體陽(yáng)性；當(dāng)血清樣本的PI<30%時(shí)，為布魯菌病抗體陰性。

1.2.5 馬日本腦炎抗體ELISA檢測(cè) 參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00，陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15。臨界值(Cut off)計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15；樣品OD值<臨界值(Cut off)，樣品為陰性；樣品OD值>臨界值(Cut off)，樣品為陽(yáng)性。

1.2.6 沙門(mén)菌檢測(cè) 按照無(wú)菌操作方式，取流產(chǎn)死胎、新生驢駒死亡后采集糞便和肝臟樣品病料，使用血液瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基和中國(guó)藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基分離沙門(mén)菌，然后將其置于37℃培養(yǎng)，對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行16 S rDNA鑒定。

2 結(jié)果

2.1 H3N8亞型流感病毒的RT-PCR檢測(cè)

對(duì)懷疑流感的樣品接種雞胚，HA檢測(cè)其血凝性，結(jié)果為陰性。對(duì)健康驢的血液和鼻咽拭子，以及有呼吸道癥狀的發(fā)病驢共170份病料進(jìn)行了流感病毒檢測(cè)，結(jié)果均為陰性(圖1)。對(duì)于有發(fā)熱、咳嗽和呼吸道炎癥癥狀的病料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分離，結(jié)果分離到金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、(洋蔥)伯克霍爾德菌等。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn);1～10.樣品；+.陽(yáng)性對(duì)照；-.陰性對(duì)照

M.DNA Marker;1-10.Samples;+.Positive control；-.Negative control

圖1部分病料流感病毒的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.1 The results of RT-PCR detection of influenza virus in part samples

2.2 馬皰疹病毒的檢測(cè)

經(jīng)哈爾濱獸醫(yī)研究所使用熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，2份死胎驢駒病料中分離到馬皰疹病毒4型(EHV-4)，發(fā)現(xiàn)EHV-4感染率為3.6%(2/55)，EHV-1病毒檢測(cè)為陰性。

2.3 布魯菌病的檢測(cè)

使用虎紅平板凝集試驗(yàn)、C-ELISA試驗(yàn)(表1)和膠體金(圖2)檢測(cè)52份病料，均為陰性。 由于所有檢測(cè)樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性，所以選取10個(gè)樣本結(jié)果進(jìn)行展示。

2.4 馬日本腦炎抗體ELISA檢測(cè)

健康成年驢血清11份、新生死亡驢駒和流產(chǎn)驢駒13份，共24份樣品，馬日本腦炎抗體均為陰性。

2.5 沙門(mén)菌的檢測(cè)

從發(fā)生驢駒死亡、流產(chǎn)和子宮炎等病料中分離沙門(mén)菌的結(jié)果均為陰性。

表1 布魯菌抗體C-ELISA檢測(cè)結(jié)果(部分)

注：+.陽(yáng)性；-.陰性。

Note：+.Positive；-. Negative.

圖2 布魯菌膠體金抗體檢測(cè)結(jié)果(部分)

3 討論

據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)報(bào)道，近5年來(lái)每年世界上許多國(guó)家都會(huì)發(fā)生數(shù)十起不同程度的馬病疫情，包括馬流感、馬傳染性貧血和皰疹病毒感染等，部分已成為地方流行性疫病，國(guó)內(nèi)也有少量馬的檢疫調(diào)查報(bào)告[12-13]。由于我國(guó)每年都從國(guó)外進(jìn)口大量的驢皮、賽馬或?qū)櫸锺R，國(guó)外疫區(qū)的非洲馬瘟、西尼羅病和馬腦病等多種烈性傳染病也可能借此進(jìn)入我國(guó)。驢養(yǎng)殖場(chǎng)會(huì)流行哪些疫病，并無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)或報(bào)道。參考其他畜禽規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病危害，推測(cè)在規(guī)模驢場(chǎng)馬流感、日本腦炎、布魯菌病和沙門(mén)菌病等常見(jiàn)疫病具有嚴(yán)重危害，而且可以感染多種動(dòng)物，甚至感染人。因此，有必要對(duì)養(yǎng)驢場(chǎng)的這些疫病進(jìn)行調(diào)查分析，以評(píng)估其感染和分布情況。

馬驢至少可以感染3種布魯菌，即B.abortus(牛布魯菌)、B.suis(豬布魯菌)和B.canis(犬布魯菌)。布魯菌病屬于慢性人獸共患傳染病，以雙相熱、關(guān)節(jié)炎、生殖系統(tǒng)侵害為特征。國(guó)外馬和驢布魯菌病的陽(yáng)性率不等[14]，但是一般不會(huì)造成感染和發(fā)病，國(guó)內(nèi)目前沒(méi)有馬屬動(dòng)物布魯菌病的流行病學(xué)材料。由于驢群多數(shù)來(lái)自牧區(qū)，所以必須進(jìn)行布魯菌病調(diào)查和檢疫。本文的調(diào)查結(jié)果顯示，目前整個(gè)區(qū)域的規(guī)模驢場(chǎng)布魯菌病處于良好的無(wú)疫狀態(tài)。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用了3種不同的檢測(cè)方法，包括使用基于布魯菌菌體、光滑型布魯菌的LPS抗原等不同層次的試劑盒檢測(cè)布魯菌，結(jié)果均為陰性。布魯菌膠體金抗體檢測(cè)試紙使用便捷，僅需5 min即可得出結(jié)果，適用于基層服務(wù)人員。布魯菌C-ELISA抗體檢測(cè)準(zhǔn)確性高。應(yīng)用虎紅凝集試驗(yàn)、布魯菌膠體金抗體檢測(cè)試紙條檢測(cè)和布魯菌C-ELISA抗體檢測(cè)，結(jié)果一致，表明這些方法可以用于驢場(chǎng)布魯菌病的調(diào)查。

自從1956年在捷克分離到H7N7亞型和1963年從美國(guó)分離到H3N8亞型流感病毒以來(lái)，馬流感在國(guó)外報(bào)道較多，我國(guó)也曾經(jīng)報(bào)道過(guò)馬流感在馬、驢和騾群體中呈暴發(fā)性流行或者檢測(cè)出較高的血清陽(yáng)性率，貴州省A型流感病毒的血清抗體陽(yáng)性率為79.49%[15]。驢群中發(fā)生流感的風(fēng)險(xiǎn)性高，特別是集約化規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的風(fēng)險(xiǎn)更大。人、豬、馬的流感均屬于H3亞型，不能排除種間傳播和病毒重組產(chǎn)生新變異毒株的可能。由于運(yùn)輸應(yīng)激、氣候驟變和驢只抵抗力降低發(fā)生呼吸道疾病(例如感冒、支氣管炎和肺炎等)后也可以繼發(fā)馬流感，也會(huì)由于馬流感繼發(fā)細(xì)菌感染。但是本次試驗(yàn)使用RT-PCR檢測(cè)了馬流感病毒的感染情況，并未檢測(cè)出該病毒的核酸成分，僅僅分離到了肺炎鏈球菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌等病原菌(另有報(bào)道)，這表明馬流感在這些規(guī)模驢場(chǎng)尚未造成嚴(yán)重感染和流行，但是需要密切監(jiān)測(cè)。

驢對(duì)日本腦炎病毒的易感性較高，在云貴川區(qū)域經(jīng)常造成嚴(yán)重發(fā)病和損失，與該病在這些區(qū)域的地方流行性有較大關(guān)系[16]，因此也是驢場(chǎng)調(diào)查的重點(diǎn)內(nèi)容。本次調(diào)查未檢測(cè)到本病發(fā)生，表明日本腦炎在這些規(guī)模驢場(chǎng)尚未造成感染，但是同樣應(yīng)該繼續(xù)密切監(jiān)測(cè)。

從流產(chǎn)驢駒的肝臟中檢測(cè)到EHV-4，表明在驢場(chǎng)存在著皰疹病毒的感染。按照文獻(xiàn)報(bào)道，EHV-1主要引起流產(chǎn)，EHV-4多引起馬呼吸系統(tǒng)癥狀，在國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多[17-18]。這表明，這種EHV-4的感染還可能不是造成流產(chǎn)的主要原因，但是應(yīng)該對(duì)此種皰疹病毒密切監(jiān)測(cè)。以上檢測(cè)可有效評(píng)估驢場(chǎng)生產(chǎn)中重要疫病的感染狀況，為準(zhǔn)確診斷病原、科學(xué)制定防疫措施提供技術(shù)支持。

在驢群可能發(fā)生的傳染病中，多種動(dòng)物共患的傳染病主要有13種，包括驢流感(Equine influenza)、沙門(mén)菌病(Salmonellosis)、大腸桿菌病(Colibacillosis)、巴氏桿菌病(Pasteurellosis)、布魯菌病(Brucellosis)、螨病/癬病(Acariasis/tinea disease)、破傷風(fēng)(Tetanus)、肉毒梭菌中毒(Botulism)、炭疽(Anthrax)、日本腦炎(Japanese encephalitis)、衣原體病(Chlamydiosis)、支原體病(Mycoplasmosis)、鉤端螺旋體病(Leptospirosis)；主要在驢發(fā)生的傳染病10種，包括馬鼻肺炎(皰疹病毒1/4型)[Equine rhinopneumonia (herpesvirus 1/4)]、馬傳染性貧血(Equine infectious anaemia)、傳染性子宮炎(Contagious equine metritis)、馬腺疫(Strangles)、馬傳染性腦脊髓炎(Equine infectious encephalomyelitis)、流行性淋巴管炎(Epizootic lymphangitis、鼻疽(Glanders)、類(lèi)鼻疽(Melioidosis)、非洲馬瘟(African horse sickness)、流行性動(dòng)脈炎(Equine viral arthritis)；其他可在驢上發(fā)生的疫病有7種，包括伊氏錐蟲(chóng)病(Trypanosomiasis evansi)、巴貝斯蟲(chóng)病(Donkey babesiosis)、媾疫(Dourine)、馬痘(Horsepox)、副結(jié)核(Paratuberculosis)、特定血清型的馬鏈球菌病(Streptococcosis of specific serotype)和葡萄球菌病(Staphylocosis)等[1,5，7]。雖然本研究的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明這些傳染病對(duì)驢群會(huì)產(chǎn)生不同程度的危害性，但是對(duì)其中幾種重要傳染病的初步調(diào)查結(jié)果表明，項(xiàng)目區(qū)的規(guī)模驢場(chǎng)處于良好的健康狀態(tài)，提示應(yīng)該堅(jiān)持自繁自養(yǎng)的發(fā)展模式，做好生物安全工作，保障驢產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

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