蔣 葛，沈 輝，萬夕和*，喬 毅

(1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通 226007；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

急性肝胰腺壞死綜合征(Acute hepatopancreas necrosis syndrome，AHPNS)是近年來影響對蝦養(yǎng)殖最為嚴重的疾病之一。早期該病主要發(fā)生于對蝦苗期，也被稱為早期死亡綜合征(Early mortality syndrome，EMS)。該病的肝胰腺壞死癥狀與對蝦其他早期死亡癥狀明顯不同，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖聯(lián)盟(NACA)將之命名為急性肝胰腺壞死綜合征(Acute hepatopancreas necrosis syndrome，AHPNS)。

1 凡納濱對蝦AHPNS流行病學(xué)

2009年，AHPNS首先在我國海南省暴發(fā)，越南、馬來西亞、泰國、菲律賓相繼暴發(fā)該病[1-2]。2011年，越南受該病影響區(qū)域超過68%；我國福建、廣東及廣西等省份因AHPNS病情影響，凡納濱對蝦產(chǎn)量下降80%以上；2012年，泰國凡納濱對蝦產(chǎn)量也因該病影響而減半[3]。2013年，太平洋東岸的墨西哥西北部地區(qū)也受到該病的影響[4]。我國華東、華北地區(qū)凡納濱對蝦主產(chǎn)地關(guān)于AHPNS的相關(guān)報道較少，影響程度相對低于華南地區(qū)。

凡納濱對蝦發(fā)生AHPNS后體色發(fā)白，蝦殼變軟，攝食明顯減少，活力減弱，行動遲緩，少數(shù)對蝦體表出現(xiàn)黑斑；肝胰腺顏色暗淡蒼白或糜爛發(fā)紅，部分對蝦的肝胰腺明顯萎縮或者異常肥大，空腸空胃。苗種投放10 d就可發(fā)病死亡,瀕死蝦很少出現(xiàn)在池邊或水面。

迄今為止，AHPNS只發(fā)生于凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦和中國明對蝦。已有的研究顯示，在凡納濱對蝦蝦苗、幼蝦階段等都能檢測到病原的存在。但近幾年來，AHPNS的發(fā)生季節(jié)不明顯，放苗60 d后常有發(fā)生。高溫季節(jié)、放養(yǎng)密度高等對蝦發(fā)病率較高，養(yǎng)殖集中區(qū)域發(fā)病率較高，單養(yǎng)池塘的對蝦患病機率和受影響程度均高于混養(yǎng)池塘。

2 病原

2.1 AHPNS病原

有關(guān)對蝦AHPNS病原的研究報道較多，已有的研究結(jié)果認為，一類攜帶有特定致病基因的弧菌是該病發(fā)生的病原，其中主要是副溶血性弧菌。藻毒素、對蝦種質(zhì)下降和環(huán)境因子等外界因子可促使對蝦發(fā)生AHPNS。

Tran L等[1]對從越南AHPNS發(fā)病蝦池中分離出1株哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)，浸泡感染后對蝦病死率達100%，死亡對蝦的臨床癥狀與病理組織學(xué)變化與AHPNS典型癥狀完全相同。Joshi J等[3]從泰國病蝦中分離出數(shù)株副溶血性弧菌，肌注感染對蝦，其中一組24 h內(nèi)100%死亡，死亡個體病理組織學(xué)變化與AHPNS病蝦相同。而另一組48 h后才出現(xiàn)死亡，所有菌株檢測均為陽性。Liu L等[5]在上海的AHPNS發(fā)病蝦池中分離出1株歐文斯氏弧菌(Vibrioowensii)，認為該菌株為AHPNS致病菌株。Xuan D等[6]認為從病蝦體內(nèi)分離的1株坎氏弧菌可導(dǎo)致AHPNS的發(fā)生。

2.2 AHPNS致病弧菌的毒力因子

副溶血性弧菌是AHPNS的主要致病菌，也是一種人漁共患的致病菌，溶血素是其主要致病因子，包括耐熱性直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)、相對耐熱直接溶血毒素( TDH-related hemolysin，TRH) 、不耐熱性溶血素 (thermolabile hemolysin，TLH)等，以TDH和TRH為主。Soto-rodriguez S A等[3]和Joshi J等[4]研究發(fā)現(xiàn)，所分離的發(fā)生AHPNS的副溶血性弧菌(VPAHPNS)泰國和墨西哥株均攜帶TLH，不攜帶TDH和TRH，這與副溶血性弧菌主要人類臨床致病菌株表型不一致，分析認為該種副溶血性弧菌導(dǎo)致人蝦共患疾病的可能性很小。Moonyoung將副溶血性弧菌的環(huán)境株、臨床株以及AHPNS株型分別感染凡納濱，發(fā)現(xiàn)AHPNS株型組24 h對蝦致死率達100%，環(huán)境株與臨床株組96 h致死率僅為0和30%，表明AHPNS株型毒力更強。同時發(fā)現(xiàn)AHPNS株型增殖時間比其他株型更快。Joshi J等[3]應(yīng)用特異性基因標(biāo)記技術(shù)在4株VPAHPNS中發(fā)現(xiàn)依賴卵磷脂溶血素(LDH)的存在。

Tang K F J等[7]對蝦VPAHPNS中獲得3個毒素復(fù)合物(TC)類似物的基因，其中富含GC區(qū)的結(jié)構(gòu)命名為tc-GIvp，它可編碼調(diào)節(jié)因子及毒素，是VPAHPNS所特有。Han J E等[8]于VPAHPNS菌株中發(fā)現(xiàn)了一段69 kb大小的隱藏質(zhì)?！皃VA1”，非VPAHPNS菌株中均沒有發(fā)現(xiàn)，分析認為該隱藏質(zhì)?？赡芫幋a了VPAHPNS的毒力因子。

Tran L等[1]利用VPAHPNS菌液上清肛門注射感染后，對蝦也表現(xiàn)出AHPNS的臨床癥狀，表明該菌株胞外產(chǎn)物具有高毒力。Sirikharin R等[9]純化VPAHPNS的菌液上清用來感染健康對蝦，48 h內(nèi)引起健康對蝦極高的死亡率，SDS瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)兩段分子質(zhì)量分別為12 ku和50 ku的蛋白PirA、PirB。

Lee C T等[10]研究發(fā)現(xiàn)，VPAHPNS產(chǎn)生的二元毒素結(jié)構(gòu)與蘇云金芽胞桿菌所產(chǎn)生的伴孢晶體結(jié)構(gòu)相似，毒力效應(yīng)也與蘇云金芽胞桿菌Cry蛋白毒力作用相似，都表現(xiàn)為插入宿主細胞膜上形成穿?？锥?，細胞內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變，使靶細胞損傷甚至死亡。將編碼兩者效應(yīng)蛋白的序列進行比對后同源性不到10%，但是卻與發(fā)光桿菌屬、短桿菌屬編碼二元蛋白質(zhì)毒素序列的同源性最為相近。

Lee將接合缺少PirvpAB操縱子的pVA1-like質(zhì)粒的VP菌株進行回歸感染試驗，結(jié)果未出現(xiàn)感染現(xiàn)象，進一步證明了PirA和PirB是AHPNS發(fā)生的主要毒力因子的觀點。Lee C T等[10]認為PirA和PirB單獨作用都可以致使健康對蝦出現(xiàn)AHPNS的臨床癥狀，當(dāng)對蝦肝胰腺檢出PirB時，肝胰腺同時出現(xiàn)了明顯的病變。Han J E等[11]在從AHPNS病蝦體內(nèi)分離出PirvpAB (+)型副溶血性弧菌2株，PirvpAB(+)坎氏弧菌4株，PirvpAB(-)型副溶血性弧菌3株，PirvpA(-)型副溶血性弧菌3株，對上述菌株進行毒力驗證，發(fā)現(xiàn)PirvpAB(-)型與PirvpA(-)型菌株并不具有毒力,這表明VP僅含有PirB基因時，并不具有致病力。

Han J E等[8]在菌株VPAHPNS13-028/A3確認含有69 kb 的質(zhì)粒pVpA3-1，其GC含量為5.9%。編碼PirA和PirB的類pir A和pir B基因位于pVpA3-1 3.5 kb片段以內(nèi)，GC含量為 38.2%，遠低于質(zhì)粒其余片段,可能是后天獲得。Lee在質(zhì)粒pVA1的序列中發(fā)現(xiàn)其含有質(zhì)粒轉(zhuǎn)移基因簇和pndA相移鍵控系統(tǒng)，這可能與該質(zhì)粒的水平基因轉(zhuǎn)移有關(guān)。Han J E等[11]發(fā)現(xiàn)PirvpAB基因與同一質(zhì)粒上的一段插入序列組成一個復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn6264，該插入序列與轉(zhuǎn)座子ISVal1同源性相近。Han認為可能有某種攜帶Tn6264的未知細菌通過質(zhì)粒接合等途徑將Tn6264轉(zhuǎn)移至弧菌基因組中，并且迅速轉(zhuǎn)移擴散。

VPAHPNS對凡納濱對蝦的免疫調(diào)控具有一定的影響。Ponprateep S等[12]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦感染VPAHPNS早期，體內(nèi)一種多功能巨球蛋白LvA2M表達受到抑制，酚氧化還原酶表達量持續(xù)上升，LvA2M對酚氧化還原酶基因的表達有一定調(diào)控作用。

3 病理學(xué)

有關(guān)對蝦AHPNS病理學(xué)方面的研究主要集中在病理組織學(xué)方面。凡納濱對蝦發(fā)生AHPNS后肝胰腺組織儲存脂肪的細胞囊泡數(shù)量明顯降低，細胞分泌活動減少，分泌細胞退化，胚胎細胞有絲分裂減少，壞死的細胞從肝胰腺腎小管基底膜掉入消化腔和腸道；肝胰腺中央?yún)^(qū)域的分泌細胞、纖維細胞和吸收細胞排列紊亂，并向外側(cè)蔓延；細胞核發(fā)生不同程度的腫大；組織間隙出現(xiàn)大量的紅細胞[13]。AHPNS病蝦腸壁變薄，腸腔變小，腸黏膜脫落，腸內(nèi)無食物或糞便，中腸管壁細胞出現(xiàn)自溶現(xiàn)象[14]。有關(guān)對蝦發(fā)生AHPNS的細胞病理學(xué)研究尚未見報道。

4 檢測技術(shù)

副溶血性弧菌是一種常見的海水細菌，可通過TCBS瓊脂等選擇培養(yǎng)基來實施檢測。但引起AHPNS的弧菌株只是其中攜帶特定致病基因的一小部分菌株。因此，通過細菌培養(yǎng)進行該病的檢測有時無法實現(xiàn)。目前，該病的診斷方法以普通PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)及實時熒光定量PCR為主。

4.1 普通PCR

2013年，F(xiàn)legel 與Lo首次公布了檢測VPAHPNS的AP1、AP2兩種引物(表1)[15]。Sirikharin R等[16]驗證發(fā)現(xiàn)AP2占有優(yōu)勢。后續(xù)研究中致病因子PirA和PirB被發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)編碼基因片段ToxA、ToxB測序分析工作完成，靈敏度更高的檢測方法也相繼被開發(fā)出來(表2)。Sirikharin等根據(jù)ToxA設(shè)計了AP3一步PCR檢測法。Soto-rodriguez S A等[3]比較認為，AP3方法更為科學(xué)。

2014年，一種套式PCR檢測技術(shù)AP4被開發(fā)出來，Dangtip S等[17]應(yīng)用104份對蝦樣品對AP4方法進行驗證，準確達100%，最低DNA檢測限可至100 fg，靈敏度比AP3提高 100倍。

表1 基于PCR檢測的AP1和AP2 兩種引物

表2 幾種引物設(shè)計基于ToxA、ToxB的PCR檢測技術(shù)

4.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增

Kongrueng J等[19]以PirvpAB-like基因(AB972427.1)為目的基因設(shè)計了4對引物，識別并擴增目的基因上的6個區(qū)域，以副溶血性弧菌的管家基因tox-R作為內(nèi)參基因，成功區(qū)別了AHPNS陰性、陽性菌株。使用Tinwongger設(shè)計的PCR方法作為對照，核酸靈敏度低至1 pg。

4.3 實時熒光定量PCR

Han J E等[20]以pirA-like為目的基因設(shè)計了TaqMan探針，建立了一種VPAHPNS定量PCR檢測方法，目的片段為135 bp。通過構(gòu)建pirA-like的標(biāo)準質(zhì)粒制作標(biāo)準曲線，越南病蝦最高檢出每mg病蝦含有5.8×105拷貝，中國病蝦樣品最高檢出每mg 含1.5×104拷貝，死亡對蝦上檢出范圍為1.8×103拷貝～4.7×106拷貝，發(fā)病池水樣每mL檢出范圍為3.5×102拷貝～2.2×106拷貝，該法最低靈敏度為10個拷貝，對于環(huán)境樣品的定量檢測和研究具有重要意義。

5 AHPNS的防控

5.1 選擇健康蝦苗

選擇不攜帶病原的種蝦和健康蝦苗是防控對蝦AHPNS關(guān)鍵措施之一。2016年，張娜等[21]使用AP3、AP4等PCR檢測方法對進口凡納濱對蝦親蝦進行AHPNS病原檢測，可有效排除存在AHPNS病原的陽性種蝦。為了培育優(yōu)質(zhì)的SPF蝦苗，應(yīng)當(dāng)在源頭上嚴格把關(guān)。選擇豐年蟲、沙蠶等生物餌料也應(yīng)進行檢疫，減少攜帶病原的生物餌料給種蝦或?qū)ξr苗種帶來的風(fēng)險。

5.2 維護養(yǎng)殖環(huán)境

大多數(shù)發(fā)病池塘存在養(yǎng)殖密度過高、過度投喂、H2S濃度偏高、過度使用生石灰、缺乏蓄水池等現(xiàn)象，建議應(yīng)加強管理，外源水須在蓄水池進行暴曬、曝氣處理。周邊一旦暴發(fā)AHPNS，換水必須嚴格操作。

王磊等[22]從對蝦養(yǎng)殖水體和對蝦腸道中分離篩選出3株兼具除氮能力的副溶血性弧菌拮抗菌，添加于含有一定量副溶血性弧菌菌液的對蝦養(yǎng)殖水體，蝦存活率達35%，可很好地調(diào)節(jié)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)。Ching S等[23]開發(fā)一種包含黏土、酵母和功能性氨基酸等黏土復(fù)合物，可吸附細菌產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物，減低VPAHPNS對養(yǎng)殖對蝦的影響，但未見更多的有關(guān)推廣應(yīng)用的報道。

5.3 餌料控制技術(shù)

張盛靜等[24]在飼料中添加地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌，可提高凡納濱對蝦的抗感染能力，酚氧化酶原、溶菌酶等表達量上升。姜禮燔等[25]從中藥成分中篩選出一種NO前體，認為對病原的滅活水平超過氟苯尼考，對于AHPNS的防治具有重要意義。

5.4 科學(xué)的投喂方式

應(yīng)根據(jù)對蝦生長情況，適時地調(diào)整投喂量，避免過度投喂。過度投喂不僅會浪費飼料，污染水質(zhì)，而且增加對蝦消化系統(tǒng)負擔(dān)，使對蝦長期處于亞健康狀態(tài)。在陰雨天、急劇降溫或升溫、pH變化劇烈、發(fā)生肝胰腺病變、出現(xiàn)白便、水體有泡沫或有異味、倒藻等情況下，應(yīng)減料或停料。

5.5 藥物防治

許多學(xué)者對藥物防治AHPNS進行了積極有效的探索。Supungul P等[26]從中國明對蝦體內(nèi)分離到一種具有抗脂多糖活性的重組蛋白rALFPm3，對于VPAHPNS具有良好的抗菌活性，最低抑菌濃度為1.25 μmol/L～5.00 μmol/L，rALFPm3可以引起VPAHPNS產(chǎn)生細胞畸變和空泡。Tinh T H等[27]從芒果和柑橘類植物中提取了一類多酚類物質(zhì)——焦培酸，可以抑制VPAHPNS，MIC為32 μg/mL～64 μg/mL。Junprung W等[28]將感染VPAHPNS的對蝦暴露于非致死性熱休克蛋白HSP70和HSP90中，試驗組存活率提高50%以上。

5.6 生物防治

2014年，Tran L H等[29]研究了對蝦與羅非魚混養(yǎng)來防治AHPNS的技術(shù)。研究認為，羅非魚具有保持微生物群體平衡的能力，在生態(tài)系統(tǒng)中，病原菌沒有繁殖的機會，細菌密度在一個比較安全的水平，另外，羅非魚的存在能有效幫助微生物系統(tǒng)應(yīng)對突然變化，降低發(fā)病率。在蝦塘中低密度放養(yǎng)羅非魚，控制底棲藻類，清理塘底，清除死蝦去除病原。Jin W J等[30]篩選得到了1株噬菌體pVp-1，能夠?qū)?2株VPAHPNS中的20株產(chǎn)生明顯的抑制作用。

6 結(jié)語

對蝦急性肝胰腺壞死綜合征是近年來對蝦養(yǎng)殖中危害最為嚴重的疾病之一，并且出現(xiàn)逐年嚴重的趨勢。目前亞洲和中南美洲地區(qū)都出現(xiàn)了嚴重的AHPNS病情，建議應(yīng)重視進口種蝦和所培育苗種的病原檢測工作，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)對該病防治的產(chǎn)品，加強基于生態(tài)養(yǎng)殖的防控技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用，以減少該病的發(fā)生。

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