王建東，馬吉鋒，侯鵬霞，于 洋，梁小軍

(寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所，寧夏銀川 750002)

奶牛圍產(chǎn)期是奶牛生產(chǎn)中重要的階段，此時由于各種因素的影響導致免疫功能低下，會出現(xiàn)圍產(chǎn)期免疫抑制，如果采取有效措施來提高圍產(chǎn)期奶牛機體免疫力，整個泌乳期疾病的發(fā)病率將會降低 90%，泌乳期產(chǎn)奶量將有大幅提高[1]。

因此，探究圍產(chǎn)期奶牛免疫抑制現(xiàn)象是奶牛圍產(chǎn)期健康研究的一個重要議題。奶牛在圍產(chǎn)期，機體經(jīng)過妊娠、分娩等一系列生理代謝變化和日糧、環(huán)境等外界因素的變化，承受各種應激而導致免疫力下降，對病原刺激不能及時有效地做出適應性應答，表現(xiàn)為免疫抑制[2]。據(jù)報道，圍產(chǎn)期奶牛的先天性和獲得性免疫防御機能均降低[3]。奶牛為何在圍產(chǎn)期出現(xiàn)免疫抑制機制尚不清楚，有人研究證實泌乳啟動和泌乳合成是造成圍產(chǎn)期母牛免疫抑制的一個因素[4]。試驗研究指出產(chǎn)犢前后幾周內(nèi)，乳房切除的母牛與產(chǎn)乳的母牛比較，產(chǎn)乳的母牛淋巴細胞功能極大地減弱，尤其分娩時。當產(chǎn)犢臨近時，乳房切除的母牛中性粒細胞功能減退，產(chǎn)犢后很快復原，而產(chǎn)乳奶牛產(chǎn)犢后中性粒細胞保持抑制狀態(tài)數(shù)周，顯示泌乳啟動的奶牛經(jīng)歷的代謝挑戰(zhàn)損害了細胞免疫功能[5]。因此，在圍產(chǎn)期階段，通過飼喂添加一些免疫增效劑來提高奶牛的機體免疫力是必要的。

枸杞子(LyciumbarbarumL)是寧夏當?shù)靥禺a(chǎn)，中華人民共和國獸藥典(2015年版)指出寧夏的枸杞是道地藥材。研究表明，枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccahrides，LBP)是枸杞子主要免疫活性成分。無論是對健康動物還是對亞健康動物，LBP均能有效提高其細胞免疫和體液免疫功能。LBP可以對小鼠IL-4 、IL-3 、TNF等的誘生具有明顯調(diào)節(jié)作用[6]。LBP還可以作用于T細胞、CTL細胞、NK細胞及腹腔巨噬細胞，提高機體的細胞免疫功能和免疫監(jiān)視系統(tǒng)的功能，具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。LBP還有增強紅細胞免疫功能的作用[7]。關(guān)于LBP是否能提高圍產(chǎn)期奶牛機體免疫力，目前還鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 免疫增效劑 奶牛用枸杞多糖免疫增效劑，主要成分為枸杞多糖，飼喂量為3 g/(頭·d),其他成分為擴容劑。

1.1.2 試驗用動物 選擇體況相近圍產(chǎn)期奶牛30頭，每天飼喂同樣的全價粉狀飼料，自制免疫增效劑用少許的粉狀飼料擴容，一次拌好7 d的量放置陰涼處，每天定時定量飼喂含有枸杞多糖免疫增效劑的飼料，試驗周期7 d。試驗分別在試驗第0天、第7天、第14天各采血1次，將第0天作為對照組，第14、7 、0天進行對照。試驗時間于2016年10月，試驗地點為寧夏中寧天寧養(yǎng)殖場，奶牛胎齡在2胎以內(nèi)。

1.1.3 主要試劑 奶牛免疫球蛋白G(IgG) (批號：20160812)、免疫球蛋白M(IgM)(批號：20160815)、免疫球蛋白A(IgA)(批號：20160812)、白細胞介素2(IL-2)(批號：20160816)、白細胞介素13(IL-13)(批號：20160813)、白細胞介素9(IL-9)(批號：20160816)、白細胞介素17(IL-17)(批號：20160812)、γ干擾素(IFN-γ)(批號：20160815)、腫瘤壞死因子β(TNF-β)(批號：20160818)等9項指標的定量檢測卡，R&D公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 酶標儀(SM-3)，北京天石天力公司產(chǎn)品；自動洗板機(ST360W)，上?？迫A公司產(chǎn)品；電熱恒溫器(HH-W21-600)，天津泰斯特有限公司產(chǎn)品；離心機(TDL80-2B)，上海安亭科學儀器有限公司產(chǎn)品；血常規(guī)分析儀(XFA6130型)，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗牛處理方法 試驗牛不進行分組，采用第0、7、14天進行組內(nèi)比較。

1.2.2 血樣采集 各組尾靜脈采血0.5 mL，室溫放置1 h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，然后于2 000 r/min離心10 min，收集血清。

1.2.3 奶牛血常規(guī)檢測 分別在試驗開始前、飼喂第7天后、飼喂結(jié)束跟蹤到第14天后各采血1次，利用血常規(guī)分析儀進行分析，測定白細胞和淋巴細胞。

1.2.4 外周血液各種免疫因子含量的檢測 分別在試驗開始前、第7天、第14天采血0.5 mL，室溫放置1 h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，然后于2 000 r/min離心10 min，收集血清，IgG、IgM、IgA、IL-2、IL-13、IL-9、IL-17、IFN-γ、TNF-β含量嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作檢測。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗結(jié)果用Spss13.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 枸杞多糖免疫增效劑對圍產(chǎn)期奶?？贵w水平和細胞因子分泌的影響

由表1可見，飼喂后7 d，IgA、IgM、IgG含量開始上升到最高，接著下降。統(tǒng)計分析表明，飼喂后7 d，IgA含量顯著高于0 d(P<0.05)，IgM、IgG含量極顯著高于0 d(P<0.01)，跟蹤14 d的含量與0 d的差異不顯著，但均高于0 d的值。

由表2可見，飼喂后7 d，IL-2、IL-13、IL-17、IL-19、TNF-α和IFN-γ含量開始上升到最高，接著下降；統(tǒng)計分析表明，在飼喂7 d后， IL-2、IL-13、IL-17、IL-19的含量均極顯著高于0 d(P<0.01)； TNF-α和IFN-γ在飼喂7 d和跟蹤14 d的含量均極顯著高于0 d(P<0.01)，表明飼喂7 d即可提高細胞因子水平。

通過表1和表2可以看出圍產(chǎn)期奶?？贵w水平和細胞因子分泌的消長規(guī)律，即7 d是高峰，接著開始下降。枸杞多糖免疫增效劑飼喂量為3 g/(頭·d)，時間為7 d可以提高圍產(chǎn)期奶牛抗體水平和細胞因子的分泌。

表1 枸杞免疫增效劑對奶牛免疫球蛋白含量的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，未標字母或字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。

Note:The different upper letters in same row indicates significant differences(P<0.01),the different lower letters in same row indicates significant differences(P<0.01),the same letters indicates no significant differences(P>0.05).

表2 枸杞免疫增效劑對奶牛細胞因子含量的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，未標字母或字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。

Note:The different upper letters in same row indicates significant differences(P<0.01),the different lower letters in same row indicates significant differences(P<0.01),the same letters indicates no significant differences(P>0.05).

2.2 枸杞多糖免疫增效劑對圍產(chǎn)期奶牛白細胞和淋巴細胞的影響

通過血液常規(guī)檢測奶牛白細胞、淋巴細胞，可以間接了解枸杞多糖免疫增效劑對提高奶牛機體免疫力效果，分析結(jié)果見表3。從表3可以看出，白細胞在飼喂中、飼喂后與飼喂前差異不顯著(P>0.05)，但飼喂后是飼喂前的1.04倍；淋巴細胞在飼喂后與飼喂前差異不顯著(P>0.05)，但飼喂后是飼喂前的1.01倍。

表3 枸杞免疫增效劑對奶牛白細胞和淋巴細胞的影響

3 討論

3.1 枸杞多糖對圍產(chǎn)期奶牛體液免疫功能的影響

奶牛圍產(chǎn)期外周血中免疫球蛋白含量的高低能反映奶牛在該時期的免疫力，免疫球蛋白可以間接反應動物機體的體液免疫功能。李剛詩等[8]研究奶牛圍產(chǎn)期血清中IgG、 IgA、 IgM含量均先降低后升高，與分娩當天相比，產(chǎn)前21 d時三者含量是減少的，而產(chǎn)后21 d時其含量仍未恢復到產(chǎn)前21 d時的水平。初乳中IgG、IgA、IgM含量隨泌乳時間的延長逐漸降低。本試驗分別在圍產(chǎn)期階段選擇試驗開始前、7天后、14天后各采血1次，檢測外周血中IgG、IgA、IgM含量的變化，從而反映該時期奶牛免疫狀態(tài)。飼喂后7 d，IgA含量顯著高于0 d(P<0.05)，IgM、IgG含量極顯著高于0 d(P<0.01)，跟蹤14 d的含量與0 d的差異不顯著，但均高于0 d的值。奶牛在圍產(chǎn)期階段處于免疫抑制狀態(tài)，表現(xiàn)為產(chǎn)前免疫球蛋白的減少和分娩前后低水平的免疫球蛋白，這些變化可能是導致圍產(chǎn)期奶牛較高發(fā)病率的原因之一，據(jù)張銀[9]研究報道，圍產(chǎn)前期添加植物提取物可提高圍產(chǎn)期奶牛血清中IgG、IgM、IgA的含量，但差異不顯著，同時對初乳中的IgM、IgA含量有提高的趨勢。本試驗研究說明在奶牛圍產(chǎn)期階段飼喂枸杞多糖，可提高奶牛圍產(chǎn)期外周血中免疫球蛋白含量。

3.2 枸杞多糖對圍產(chǎn)期奶牛細胞免疫功能的影響

據(jù)研究有些細胞因子在臨近分娩時升高，分娩后下降。有些在臨近分娩時下降，分娩后升高，但通過中藥免疫增強劑可以極顯著提高血清中某些細胞因子[10]。本試驗分別在圍產(chǎn)期階段試驗開始前、第7天、第14天各采血1次，檢測外周血中IL-2、IL-13、IL-9、IL-17、IFN-γ、TNF-β含量的變化，從而反映該時期奶牛機體免疫狀態(tài)，在飼喂第7天，IL-2、IL-13、IL-17、IL-19的含量均極顯著高于0 d(P<0.01)；TNF-α和IFN-γ在飼喂7 d和14 d的含量均極顯著高于0 d(P<0.01)，表明飼喂7 d即可提高圍產(chǎn)期奶牛相關(guān)細胞因子。

3.3 枸杞多糖對圍產(chǎn)期奶牛白細胞和淋巴細胞的影響

李剛詩等[8]研究奶牛圍產(chǎn)期血液中的細胞，臨近分娩和分娩后，奶牛外周血的白細胞、淋巴細胞呈持續(xù)下降趨勢，主要原因就是免疫抑制。本試驗通過在圍產(chǎn)期飼喂枸杞免疫增效劑，結(jié)果表明白細胞在飼喂中、飼喂后與飼喂前差異不顯著(P>0.05)，但飼喂后是飼喂前的1.04倍；淋巴細胞在飼喂后與飼喂前差異不顯著(P>0.05)，但飼喂后是飼喂前的1.01倍。說明枸杞多糖具有提高圍產(chǎn)期奶牛免疫力的作用。

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[7] 劉英娟,杜金梁,賈 睿,等．枸杞多糖對四氯化碳致建鯉急性肝損傷的保護作用[J]． 浙江農(nóng)業(yè)學報，2015，27(1):37-43．

[8] 李剛詩,王曉艷,袁 聽,等.圍產(chǎn)期健康奶牛血清和初乳中免疫球蛋白含量的變化[J].中國獸醫(yī)學報,2015,35(2):273-277.

[9] 張 銀.中國畜牧獸醫(yī)學會動物營養(yǎng)學分會第十二次動物營養(yǎng)學術(shù)研討會論文集[M].北京：中國社會科學出版社，2016.

[10] 孫躍博.中藥方劑對圍產(chǎn)期奶牛免疫功能和泌乳性能影響的研究[D].新疆石河子：石河子大學，2016.