王曉朋，侯艷麗，鄒頌平，張夢(mèng)丹，羅俊崇，王 凱*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528000；2.四會(huì)市畜牧獸醫(yī)局，廣東肇慶 526000)

犬急性腎損傷(acute kidney injury ,AKI)多為可逆性損傷，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療可防止其發(fā)展成為實(shí)質(zhì)性腎衰[1]。臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，AKI缺乏早期診斷指標(biāo)和有效干預(yù)，是造成動(dòng)物死亡的重要原因，干預(yù)的滯后性是因?yàn)槿狈τ袃r(jià)值的早期的腎損傷標(biāo)志物。目前，檢測(cè)腎臟損傷主要指標(biāo)為血清肌酐(creatinine,CREA)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)。大量臨床資料表明，CREA和BUN并不是腎損傷的敏感指標(biāo)，腎臟的排泄功能喪失50%以上時(shí)，血清中CREA和BUN才可能會(huì)明顯升高，且出生1周內(nèi)的小狗即使有腎臟損傷，其CREA和BUN也不會(huì)升高[2]。犬腎損傷早期診斷標(biāo)志物的缺乏造成許多患病動(dòng)物錯(cuò)失最佳干預(yù)時(shí)機(jī)，因此探究早期、靈敏、特異的犬腎損傷標(biāo)志物對(duì)于臨床上早期診斷腎臟疾病，及時(shí)進(jìn)行干預(yù)和治療具有重要的意義。隨著疾病發(fā)生原因的復(fù)雜化和聯(lián)合用藥的廣泛化，腎毒性藥物成為導(dǎo)致AKI的重要原因之一，醫(yī)學(xué)上20%的AKI是由藥物導(dǎo)致的[3]，因此研究腎毒性腎損傷標(biāo)志物，對(duì)于此類疾病的早期診斷和治療具有重要意義。

急性腎損傷標(biāo)志物是腎臟受到損害時(shí)能夠快速、靈敏地檢測(cè)出腎臟早期的、低水平的一種生物標(biāo)志物，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)上腎臟損傷研究的熱點(diǎn)之一。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道的與腎臟有關(guān)的腎損傷標(biāo)志物已達(dá)30多種，且視黃醇結(jié)合蛋白(N-acetyl-β- glucosaminidase，RBP)和N-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β- glucosaminidase，NAG) 已成為人類醫(yī)學(xué)上經(jīng)典的腎小管損傷標(biāo)志物，能夠反映腎小管的功能變化[4]。新的腎損傷標(biāo)志物也逐漸被發(fā)現(xiàn)，一些特異性、靈敏度高的的腎小管損傷標(biāo)志物已在試驗(yàn)研究和臨床觀察中得到了部分驗(yàn)證，如腎損傷分子(kidney injury molecule，KIM-1)和中性粒細(xì)胞明膠酶運(yùn)載脂蛋白(neutrophil gelatinase relted lipid transfer protein，NGAL)。目前，腎損傷標(biāo)志物的研究?jī)H在急性腎臟損傷的病人和大鼠上進(jìn)行，而獸醫(yī)臨床上對(duì)于這方面的研究基本處于空白階段。隨著小動(dòng)物診療技術(shù)的飛速發(fā)展，快速、靈敏、 高效、敏感的腎損傷標(biāo)志物成為臨床診斷腎臟損傷的新需求。本試驗(yàn)通過(guò)復(fù)制腎毒性腎損傷模型，通過(guò)對(duì)比分析的方法篩選犬急性腎損傷標(biāo)志物，為犬腎臟損傷早期敏感標(biāo)志物的篩選提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 8月齡10 kg±1 kg的中華田園犬10只，雌雄各半，單籠常規(guī)飼養(yǎng)，飼喂全價(jià)商品犬糧，常規(guī)免疫、驅(qū)蟲(chóng)后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.1.2 試劑 異氟烷，河北一品制藥有限公司產(chǎn)品；硫酸慶大霉素注射液，遂成藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；RBP、NGAL、KIM-1、NAG ELISA檢測(cè)試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 切片機(jī)(RM 2016)、組織包埋機(jī)(KD-BM)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(iMark Bio-Rad Laboratories,Inc.)、全自動(dòng)生化分析儀，SP-4430 愛(ài)科來(lái)醫(yī)療電子有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組與犬腎毒性腎損傷模型的復(fù)制 試驗(yàn)犬隨機(jī)編號(hào)為1號(hào)～10號(hào)犬。注射藥物前檢測(cè)每只試驗(yàn)犬尿液和血液中RBP、NAG、KIM-1、NGAL濃度作為自身對(duì)照。按照每千克體重8萬(wàn)單位的劑量于每天上午9點(diǎn)一次性皮下注射硫酸慶大霉素，連續(xù)注射9 d[5]。注射藥物后每天檢測(cè)尿液、血液生物標(biāo)志物濃度數(shù)據(jù)各作為1個(gè)試驗(yàn)組數(shù)據(jù)。注射藥物6 h后采集試驗(yàn)犬尿液和靜脈血液，樣品采集期間試驗(yàn)犬應(yīng)禁食，給予少量飲水。樣品收集后3 000 r/min離心5 min，取上清液放置在-80℃保存，用于檢測(cè)尿液和血液中RBP、NAG、KIM-1、NGAL的濃度。試驗(yàn)第3天、第6天、第9天隨機(jī)選取1只試驗(yàn)犬，安樂(lè)后取腎臟，用于組織病理組織學(xué)檢查。

1.2.2 血清CREA、BUN濃度的檢測(cè) 于試驗(yàn)前、試驗(yàn)第3天、第6天、第9天，采集試驗(yàn)動(dòng)物前肢靜脈血，5 000 r/min離心5min，取上清液進(jìn)行血清生化檢測(cè)。

1.2.3 尿液和血清中腎損傷生物標(biāo)志物濃度的檢測(cè) 按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，依次檢測(cè)尿液和血液中RBP、NAG、KIM-1、NGAL的濃度。對(duì)于超出檢測(cè)正常范圍的檢測(cè)樣品，稀釋一定的比例后再進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)犬臨床觀察

試驗(yàn)犬試驗(yàn)第5天開(kāi)始食欲下降，嘔吐，多尿，飲水量增多，精神萎靡，試驗(yàn)第7天尿量減少，試驗(yàn)第9天機(jī)體脫水明顯，體重降低顯著，基本無(wú)尿。

2.2 腎臟組織病理學(xué)檢查及腎損傷評(píng)

由圖1腎臟病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，試驗(yàn)犬在給藥后出現(xiàn)了與慶大霉素腎毒性腎損傷相關(guān)的典型的腎臟病理學(xué)變化。改變主要包括腎小管內(nèi)血液淤積，上皮細(xì)胞變性，壞死，腎小管腔擴(kuò)張，小管管型，腎小管基底膜裸露。隨用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，腎臟損傷程度逐漸加重，試驗(yàn)第3天腎小管出現(xiàn)血液淤積，小管細(xì)胞脫落，腎臟輕度損傷。試驗(yàn)第6天，腎小管管腔擴(kuò)張，部分腎小管壞死，管腔內(nèi)有小管管型，腎臟中度至重度損傷。試驗(yàn)第9天，腎小管壞死嚴(yán)重，基底膜脫落，腎小管腫脹，腎臟重度損傷。

a.表示正常腎小管； b.表示血細(xì)胞淤積； c.表示腎小管細(xì)胞脫落；d.表示腎小管脫落壞死；e.表示腎小管基底膜裸露

A.對(duì)照腎臟組織；B.用藥3天后腎臟組織；C.用藥6天后腎臟組織；D.用藥9天后腎臟組織

a.Indicates normal renal tubules；b.Indicates blood cell deposition；c.Indicates renal tubular cell abscission；d.Indicates renal tubular necrosis；e.Indicates bare basement membrane of renal tubule

A.The kidney tissue of the control group; B.The kidney tissue after adminstration for 3 days; C.The kidney tissue after adminstration for 6 days; D.The kidney tissue after adminstration for 9 days

圖1給藥前后犬腎臟病理變化(HE 40×)

Fig.1 Histopathological lesions of canine kidney before and after administration(HE 40×)

2.3 腎臟B超檢查結(jié)果

從B超圖2可知，用藥6 d前，腎臟輪廓清晰，大小幾乎沒(méi)有改變，第9天腎臟輪廓略模糊，腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)界限不清晰，皮質(zhì)回聲增強(qiáng)。

A .用藥前腎臟B超；B.用藥3天腎臟B超；C.用藥6天腎臟B超；D.用藥9天腎臟B超

A.The B ultrasonic imaging of the kidney in control group; B.The B ultrasonic imaging of the kidney after adminstration for 3 days; C.The B ultrasonic imaging of the kidney after adminstration for 6 days; D.The B ultrasonic imaging of the kidney after adminstration for 9 days

圖2給藥前后犬腎臟B超圖

Fig.2 The B ultrasonic imagings in kidney of dog before and after administration

2.4 試驗(yàn)犬血清生化CREA、BUN濃度檢測(cè)結(jié)果

從表 1中可以看出，試驗(yàn)第3天，血清中CREA、BUN濃度均在正常范圍內(nèi)，腎臟病理檢查結(jié)果顯示腎臟輕度損傷。試驗(yàn)第6天有3只試驗(yàn)犬血清CREA濃度升高，組織病理學(xué)結(jié)果顯示腎臟中度至重度損傷。試驗(yàn)第9天7只試驗(yàn)犬中6只CREA、BUN濃度升高，組織病理學(xué)結(jié)果顯示腎臟損傷非常嚴(yán)重。試驗(yàn)結(jié)果表明,血清CREA和BUN對(duì)腎臟損傷情況的評(píng)估具有滯后性，不靈敏性。

表1 給藥前后血清CRE、BUN濃度變化

注：BUN參考范圍：2.5 mmoL/L～9.5 mmoL/L，CRE參考范圍：44 mmoL/L～159 mmoL/L。

Note:BUN reference range: 2.5 mmol/L-9.5 mmol/L, CRE reference range: 44 mmol/L-159 mmol/L.

2.5 尿液中生物標(biāo)志物濃度的檢測(cè)結(jié)果

表2結(jié)果顯示，尿液中RBP、NAG、KIM-1、NGAL濃度隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，與腎臟損傷程度有良好的相關(guān)性。在試驗(yàn)第1天、第2天、第3天、第4天尿液中KIM-1、NGAL、RBP、NAG濃度分別顯著升高(P<0.05)，顯著升高時(shí)間均早于血清中的CREA和BUN。

表2 給藥前后尿液中腎損傷標(biāo)志物濃度變化

注：同列相同字母標(biāo)志差異不顯著，不同字母表示差異顯著。

Note: In the same column, different letters show significant difference, and the same letters show no significant difference.

2.6 血清中生物標(biāo)志物濃度的檢測(cè)結(jié)果

由表 3 結(jié)果可知，血液中RBP、NAG、KIM-1、NGAL濃度隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，與腎臟損傷程度有良好的相關(guān)性。試驗(yàn)第3天血液中NAG、KIM-1濃度顯著高于試驗(yàn)前，顯著升高時(shí)間早于CREA和BUN。試驗(yàn)第5天血液中RBP、NGAL濃度顯著高于試驗(yàn)前，顯著升高時(shí)間與CREA和BUN 升高時(shí)間基本相同。

表3 給藥前后腎損傷血清中標(biāo)志物的濃度變化

注：同列相同字母標(biāo)志差異不顯著，不同字母表示差異顯著。

Note: In the same column, different letters show significant difference, and the same letters show no significant difference.

3 討論

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，連續(xù)用藥5 d，試驗(yàn)犬表現(xiàn)出臨床癥狀，試驗(yàn)第7天臨床癥狀明顯，腎臟組織病理學(xué)結(jié)果顯示此時(shí)腎臟受損程度為中度至重度。B超檢查結(jié)果顯示，試驗(yàn)過(guò)程中腎臟輪廓和大小基本未見(jiàn)明顯變化，在連續(xù)用藥6 d后才可能出現(xiàn)比較明顯的腎臟損傷影像，此時(shí)腎臟受損程度為中度至重度。血清中檢查結(jié)果CREA、BUN在連續(xù)用藥第6天才開(kāi)始顯著升高，腎臟受損程度為中度至重度。以上結(jié)果表明，目前采用的腎臟損傷檢測(cè)方法只有在腎臟受損程度在中度至重度以后才有可能比較明顯，不能對(duì)腎臟損傷早期做出判斷，延誤了腎臟損傷的最佳治療時(shí)機(jī)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，尿液和血液中4種腎損傷標(biāo)志物濃度變化與腎臟損傷具有良好的相關(guān)性。尿液中RBP濃度在試驗(yàn)第3天顯著升高，早于CREA和BUN升高時(shí)間，此時(shí)腎臟為輕度損傷，可作為腎毒性腎損傷早期敏感標(biāo)志物，與楊浩強(qiáng)[6]采用順鉑建立的急性腎損傷模型尿液檢測(cè)結(jié)果相同。血液中RBP濃度在試驗(yàn)第5天顯著升高，早于CREA和BUN，但此時(shí)腎臟為中度至重度損傷，因此血液中RBP不能作為腎毒性腎損傷早期敏高標(biāo)志物。尿液和血液中NAG濃度在試驗(yàn)第3天尿液顯著升高，早于CREA和BUN升高時(shí)間，此時(shí)腎臟為輕度損傷，因此可作為腎毒性腎損傷早期敏感標(biāo)志物。此結(jié)果與周曉冰[7]等在硫酸慶大霉素腎毒性損傷模型中檢測(cè)的結(jié)果基本相同，不同的是他們的試驗(yàn)中尿液中NAG在注射藥物第1天即顯著升高，而本試驗(yàn)是在注射藥物第3天濃度顯著升高。造成這種差異的原因可能是他們的試驗(yàn)中腎毒性腎損傷模型采用的是肌肉注射硫酸慶大霉素，較皮下注射藥物吸收更快、更充分，對(duì)腎臟損傷更早更嚴(yán)重，所以NAG尿液濃度才會(huì)升高更快。尿液和血液中KIM-1的濃度分別在試驗(yàn)第1天和試驗(yàn)第3天顯著升高，早于CREA和BUN升高時(shí)間，此時(shí)腎臟為輕度損傷，因此可作為腎毒性腎損傷早期敏感標(biāo)志物，與曾凡智等[8]試驗(yàn)結(jié)果相同。尿液中NGAL的濃度在試驗(yàn)第2天顯著升高，早于CREA和BUN升高時(shí)間，此時(shí)腎臟為輕度損傷，因此可作為腎毒性腎損傷早期敏感標(biāo)志物。此結(jié)果與楊浩強(qiáng)在大鼠上的檢測(cè)結(jié)果相同。血液中NGAL的濃度在試驗(yàn)第5天顯著升高，早于CREA和BUN的升高時(shí)間，但此時(shí)腎臟為中度至重度損傷，因此血液中NGAL濃度不能作為腎臟損傷早期敏感標(biāo)志物。

目前，急性腎損傷標(biāo)志物的研究主要集中在人類醫(yī)學(xué)尿液標(biāo)志物的研究，獸醫(yī)臨床在這方面的研究基本處于空白。本試驗(yàn)復(fù)制了急性腎毒性腎損傷模型，探索了腎損傷程度與4種腎損傷標(biāo)志物尿液和血液濃度變化的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明，尿液中4種腎損標(biāo)志物濃度變化均與腎損傷程度呈正相關(guān)，且升高時(shí)間早于CREA、BUN，可作為急性腎損傷早期診斷標(biāo)志物。血液中4種腎損傷標(biāo)志物NAG和KIM-1靈敏度較好，可作為腎毒性腎損傷血液中靈敏的腎損傷標(biāo)志物。臨床上血液樣品較尿液樣品容易采集，篩選出血液和尿液靈敏度都較高的腎損傷標(biāo)志物，對(duì)于獸醫(yī)臨床上急性腎衰竭早期的診斷具有重要意義。綜合來(lái)說(shuō)，NAG和KIM-1作為急性腎毒性腎損傷的早期診斷標(biāo)志物更有利于在獸醫(yī)臨床中開(kāi)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] Morgan R V.小動(dòng)物臨床手冊(cè)[M].4版.施振聲，譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版，2005：502-509.

[2] Dennis J C，Stephen P D，Patricia A S .犬貓腎臟及泌尿?qū)W[M].2版.譚大倫，譯.中國(guó)臺(tái)灣：臺(tái)灣愛(ài)思唯爾有限公司，2013：63-92.

[3] 范倩倩，孔旭東，鄧 昂，等.藥源性急性腎損傷研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物警戒，2015(12)：164-168.

[4] Tanlinson P A.Low molecular weight proteins in children with renal disease[J].Pediatr Nephrol，1992(6)：565-571.

[5] 周光興，高 誠(chéng)，徐 平， 等.人類疾病動(dòng)物模型復(fù)制方法學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2007：502-503.

[6] 楊浩強(qiáng).尿RBP、NGAL在順鉑致大鼠急性腎損傷中的變化及意義研究[D].廣西南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2014.

[7] 周曉冰.大鼠與Beagle犬腎毒性生物標(biāo)記物及腸道病毒71型滅活疫苗臨床前安全性的研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2014.

[8] 曾凡智，肖創(chuàng)清，黃志紅，等.硫酸慶大霉素誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷模型血和尿NGAL、KIM-1的變化及意義[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2016(2)：140-143，165.