侯美如，尹珺伊，王 巖，劉 宇，陳楠楠，秦平偉，史同瑞

(黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006)

黃芪(Astragalus)系常用扶正中藥之一，具有益氣固表、補氣養(yǎng)血、利水消腫、脫毒、斂瘡生肌等功能[1]，被廣泛應用于人類及動物疾病的預防與治療中。隨著對黃芪制劑研究的逐步深入，應用微生物發(fā)酵手段替代傳統(tǒng)炮制技術的研究也取得了一定的進展[2]。由于黃芪發(fā)酵產(chǎn)物受發(fā)酵物料組分、發(fā)酵菌種及發(fā)酵工藝等因素的影響，因此其有效活性成分的含量也不相同。黃芪中的主要活性成分是黃芪甲苷(astragaloside)，黃芪甲苷也是《中國藥典》中黃芪質(zhì)量標準檢測的標志物[3]。由于藥典中使用的檢測方法是薄層掃描法[4]與高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(high performance liquid chromatography couple with evaporative light scatting detector，HPLC-WLSD)[3]檢測法，這些方法在含量測定中存在著試劑腐蝕性強、試驗誤差大、蒸發(fā)光散射器普及面不廣等問題。為豐富黃芪發(fā)酵程度及產(chǎn)品質(zhì)量評價方法，本文應用高效液相色譜-紫外檢測法(high performance liquid chromatography couple with ultraviolet detector，HPLC-UV)檢測黃芪甲苷含量，同時，比較黃芪固態(tài)發(fā)酵對黃芪甲苷含量的影響，為發(fā)酵黃芪制品的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持，為生產(chǎn)應用提供質(zhì)量保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備 日本島津SPD-20A紫外檢測器、LC-20AT二元泵、Labsolution色譜工作站，日本島津公司產(chǎn)品；KQ5200B超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；ZNCL-S自能恒溫磁力攪拌器，上海羌強儀器設備有限公司產(chǎn)品；PINE-TREE帕恩特標準試劑級超純水機，北京湘順源科技有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩器HZQ-FX型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 菌株與試劑 產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽胞桿菌SSY1株，由黑龍江省獸醫(yī)科學研究所細菌研究室分離鑒定并保存；黃芪甲苷標準品(含量98%，批號20160924)，購自上海金穗生物科技有限公司；黃芪，購自河北凱達藥業(yè)有限公司；乙腈(色譜純，批號20161210)、甲醇(色譜純，批號20161108)，購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準品制備 精密稱取4.8 mg黃芪甲苷標準品，置于10 mL容量瓶中，加入適量流動相，超聲溶解，定容至刻度，備用。

1.2.2 發(fā)酵黃芪及對照品制備

1.2.2.1 黃芪發(fā)酵 按照黃芪粉30%、黃豆粉10%、CaCO30.2%、水59.8%組分制備發(fā)酵培養(yǎng)基。取解淀粉芽孢桿菌種子液，以2%接種量接種黃芪發(fā)酵培養(yǎng)基，在37℃發(fā)酵培養(yǎng)72 h，發(fā)酵物中活菌數(shù)約為7.67×108CFU/g。

1.2.2.2 對照品 另外取無菌肉湯，按2%接種量接種黃芪固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，按照發(fā)酵黃芪制備方法進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3 有效成分的提取 取發(fā)酵組及對照組固體培養(yǎng)基各5 g，分別加水50 mL，置于微量振蕩器上混勻1 h，離心取上清，分別置于分液漏斗中，加入正丁醇50 mL，進行萃取。棄液再次用正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，加入10 g/LNaOH溶液100 mL，洗滌3次，除色素后用超純水洗至中性，收集正丁醇溶液，置70℃水浴揮干溶劑，加甲醇溶解，待完全溶解后定容至5 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，超聲除氣，備用。

1.2.4 色譜條件 Inertsustain C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈、水(32∶68)，檢測波長203 nm，柱溫25 ℃，流速1 mL/min，進樣量：20 μL。

1.2.5 系統(tǒng)適應性試驗 分別取標準品、發(fā)酵黃芪組及對照組黃芪甲苷提取液，經(jīng)超聲，過0.45 μm濾膜后進樣20 μL，對方法系統(tǒng)適應性進行考察。

1.2.6 線性關系考察 用流動相稀釋黃芪甲苷標準品溶液，稀釋濃度分別為0.48、0.36、0.24、0.12、0.06 mg/mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，超聲除氣，備用。按上述色譜條件對黃芪甲苷含量進行測定，以液相色譜峰峰面積(A)對濃度(C)繪制標準曲線。

1.2.7 精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷標準品溶液20 μL，重復進針6次，測定的黃芪甲苷峰面積，對方法精密度進行考察。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗 取黃芪甲苷標準品分別于0、2、4、6、8、10 h進樣1次，對方法穩(wěn)定性進行考察。

1.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的黃芪粉末各3份，分別加入黃芪甲苷標準品溶液0.5、0.25、0.125 mL，按1.2.3有效成分的提取方法進行操作，測定峰面積，計算回收率。

1.2.10 樣品含量測定 取黃芪發(fā)酵組及對照組黃芪甲苷提取液各20 μL，按上述色譜條件對黃芪甲苷含量進行測定。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應性試驗

由圖1可知，標準品、發(fā)酵黃芪組及對照組黃芪甲苷提取液分別在2.149、2.165、2.157 min的保留時間出現(xiàn)獨立峰。

2.2 線性關系考察

以液相色譜峰峰面積(A)對濃度(C)繪制標準曲線，結(jié)果見圖2。其回歸曲線為A=2 034 519.61C-4711.54，相關系數(shù)R2=0.999 3，線性范圍為0.06 mg/mL～0.48 mg/mL，結(jié)果表明線性回歸較好。

A.黃芪甲苷標準品色譜圖；B.對照組及發(fā)酵組黃芪甲苷色譜圖；1.黃芪甲苷標準品；2.發(fā)酵組黃芪甲苷；3.對照組黃芪甲苷

A.Chromatogram of astragaloside standard; B.Chromatograms of astragaloside in control group and fermentation group；1.Astragaloside standard; 2.Fermentation group astragaloside; 3.Control group astragaloside

圖1黃芪甲苷色譜圖

Fig.1 Chromatogram of astragaloside

圖2 黃芪甲苷標準曲線

2.3 精密度試驗

黃芪甲苷標準品溶液，重復進針6次，測定的黃芪甲苷峰面積分別為700 587、683 752、712 945、694 757、705 461，RSD為1.58%，表明方法精密度符合要求。

2.4 穩(wěn)定性試驗

對黃芪甲苷標準品于不同時間點進針，測得峰面積分別為700 587、723 413、695 423、687 562、713 549，RSD為2.04%，結(jié)果表明，黃芪甲苷在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收率試驗

由表1可以看出，該方法回收率高，穩(wěn)定性強，平均回收率可達99.75%。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.6 樣品含量測定

由表2可知，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)72 h，黃芪發(fā)酵組與不接菌對照組黃芪甲苷質(zhì)量分別為6.336 mg/g±0.002 1 mg/g和4.593 mg/g±0.002 5 mg/g，發(fā)酵組黃芪甲苷含量明顯高于對照組，較對照組高37.95%。

表2 發(fā)酵黃芪中總皂苷含量的變化

3 討論

黃芪甲苷含量的檢測方法有薄層色譜法、香草醛-比色法及高效液相色譜法等。已有報道中多采用薄層色譜法，且在2000版《中國藥典》[4]及2000年版《中國獸藥典》[5]均應用薄層色譜法檢測黃芪甲苷含量，該方法能夠提供圖像用以直接觀測并傳達色譜結(jié)果，制備量大，成本低，速度快，但前處理步驟較多，人為影響因素大，排除干擾困難，準確度差，重現(xiàn)性不好[6]。香草醛-比色法所用試劑具有刺激性氣味，腐蝕性強，操作人員需做好必要的防護。由于黃芪甲苷僅在波長200 nm處附近有末端吸收，因此，在《中華人民共和國藥典》2010年版一部及2015年版一部[3,7]中均采用蒸發(fā)光散射器(HPLC-ELSD)對黃芪甲苷含量進行檢測，但蒸發(fā)光散射器成本高，普及率低，還需要配置高壓氮氣或空氣，且試驗中還產(chǎn)生有害廢氣。紫外檢測器為高相液相色譜的標準配置，不僅靈敏度高、噪音低、線性范圍寬、有較好的選擇性，且對環(huán)境溫度、流動相組成變化和流速波動不太敏感，可等濃度洗脫，亦可梯度洗脫。因此，HLPC-UV法更易被廣泛的應用于黃芪甲苷的質(zhì)量檢測。

對于HLPC-UV方法中檢測波長和流動相的選擇上，由于黃芪甲苷在近紫外區(qū)僅在200 nm左右有末端吸收，文獻中多在200 nm～210 nm處選擇檢測波長，波長越長噪音越小，但靈敏度亦下降，常選用的波長為200、203、205 nm處，檢測流動相多以乙腈-水，選取的濃度不盡相同[8-12]。通過對以往報道中的檢測波長及濃度進行篩選，本文建立的HPLC-UV色譜檢測條件采用了等濃度洗脫，流動相選擇乙腈∶水(32∶68)、流速1.0 mL/min、檢測波長為203 nm，試驗證明，該條件下黃芪甲苷的峰形對稱，尖銳，與樣品本底有良好的分離，且該方法在0.06 mg/mL～0.48 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，精密度及回收率高，穩(wěn)定性好，適用于固態(tài)發(fā)酵黃芪中黃芪甲苷含量的檢測。

本文應用分離的解淀粉芽胞桿菌對黃芪固體發(fā)酵72 h，經(jīng)液相色譜法測定，黃芪甲苷質(zhì)量分數(shù)較對照組提高了37.95%，這與許多學者的研究結(jié)果相一致。王士中[13]運用糙皮側(cè)耳菌對黃芪進行發(fā)酵，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后黃芪甲苷含量增加，但增加幅度不高，其推測是由于糙皮側(cè)耳菌在發(fā)酵生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的豐富酶系，如纖維素酶、半纖維素酶、漆酶及果膠酶等，對黃芪中木質(zhì)纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及果膠等物質(zhì)進行分解利用，將黃芪的活性成分充分釋放，使黃芪甲苷含量增加。孫豪棟[14]通過篩選和誘變育種，獲得可以將黃芪皂苷轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷的微生物菌株，以突變的傘枝犁頭霉作為菌種，進行發(fā)酵處理，使黃芪甲苷產(chǎn)率從28.3%增加至31.1%，進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，黃芪甲苷產(chǎn)率最高可達42.86%。馬偉等[15]運用保加利亞乳酸桿菌發(fā)酵黃芪，其黃芪總皂苷質(zhì)量分數(shù)顯著升高，增長了22%。而郁帥陸等[16]運用靈芝液體種子液對黃芪固體培養(yǎng)基進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷含量降低，其推測可能因高溫滅菌，使連接苷元和多糖的多糖苷鍵部分斷裂，并生成非極性皂苷元，而不能經(jīng)極性較大的甲醇提取到，使檢測結(jié)果降低。

由于發(fā)酵技術的影響因素是多方面的，受到發(fā)酵菌種、發(fā)酵成分及發(fā)酵條件等因素的影響，產(chǎn)生的活性物質(zhì)也有所增加或減少，原因也各異，本試驗僅對黃芪甲苷的含量變化進行了測定，而并未對其他成分變化進行檢測。為探究引起成分增加的原因，筆者對本文分離得的解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)纖維素酶性質(zhì)進行了研究，發(fā)現(xiàn)該菌種具有產(chǎn)纖維素酶的能力。有報道指出纖維素酶可提高黃芪有效成分的釋放[17]，這可能是本試驗發(fā)酵黃芪甲苷含量增加的原因之一。但本試驗導致黃芪甲苷含量增加的原因，是解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)纖維素酶分解細胞壁，使有效成分釋放，或是由菌種將黃芪皂苷轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷，亦或是由非極性皂苷元轉(zhuǎn)化為可溶于甲醇溶劑皂苷的結(jié)果，仍需進一步的試驗和數(shù)據(jù)加以證實。

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