郭 曉，朱曉慶，商云霞，谷新利，楊紅洋

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

中藥作為中國傳統(tǒng)藥物，以其毒副作用較小、殘留低等優(yōu)勢作為提高動物免疫力的免疫增強(qiáng)劑，被廣泛研究并運(yùn)用到畜禽生產(chǎn)中，以有效增強(qiáng)畜禽機(jī)體抵抗病原的能力。中藥有效成分中的多糖是起免疫增強(qiáng)作用的主要成分之一，從1936年Shear發(fā)現(xiàn)多糖具有抗腫瘤活性后，人們就已經(jīng)開始關(guān)注多糖對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[1]。近年來，人們對多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的研究已不再停留在測定幾個(gè)免疫指標(biāo)的變化上，而是深入到細(xì)胞、分子、基因等多種水平。隨著Toll樣受體/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信號通路及其生物學(xué)功能的發(fā)現(xiàn)，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面存在多種多糖受體(如TLR2、TLR4、CR3等)，多糖能與這些受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，促進(jìn)免疫細(xì)胞分化增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2-3]。與此同時(shí)，雞主要組織相容性復(fù)合體B-Lβ基因第2外顯子(major histocompatibility complex B-LβⅡ,MHC B-LβⅡ)具有豐富的多態(tài)性，它使不同個(gè)體對相同抗原表現(xiàn)出不同的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能存在個(gè)體差異。本研究采用PCR-SSCP方法對試驗(yàn)雞進(jìn)行MHC B-LβⅡ基因分型后，以不同MHC B-LβⅡ基因型雞外周血淋巴細(xì)胞為研究對象，觀察用TLR2抗體處理的雞淋巴細(xì)胞中IL-6、TNF-α、NF-κB質(zhì)量濃度的變化，初步探討中藥復(fù)方多糖(traditional Chinese medicine compound polysaccharides, cCHMPS)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的受體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用藥物 中藥復(fù)方由當(dāng)歸、黨參、熟地、川芎、山楂、何首烏、淫羊藿、麥冬、茯苓、補(bǔ)骨脂和黃芪11味中藥組成，各單味藥均購自石河子市醫(yī)藥公司。中藥復(fù)方經(jīng)水提-醇沉法提取得到粗中藥復(fù)方多糖(cCHMPS)后，用AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附獲得一定純度的cCHMPS，其多糖含量為77.10%。用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將其配制成200 μg/mL的中藥復(fù)方多糖母液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)用動物及分組 黃麻肉雞購自石河子市孵化場，臨床檢查健康，根據(jù)MHC B-LβⅡ基因第2外顯子PCR-SSCP的檢測結(jié)果分組，再將每種基因型雞分成高濃度(2 μg/mL)，中濃度(1 μg/mL)，低濃度(0.5 μg/mL)TLR2抗體組和空白對照組。

1.1.3 主要試劑及儀器 血液基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；PCR Mixture，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；雞淋巴細(xì)胞分離液 ，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司 產(chǎn)品；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基，GIBCO公司產(chǎn)品；Hank's液，北京博奧拓科技有限公司產(chǎn)品；TLR2抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；雞IL-6、TNF-α、NF-κB ELISA檢測試劑盒，上海藍(lán)基生物科技有限公司產(chǎn)品；二甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)，Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；酶標(biāo)儀(美國熱電FC型號)，垂直離心機(jī)，微量移液器，恒溫培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 MHC B-LβⅡ基因分型 采集黃麻肉雞外周血，按照DNA提取試劑盒說明書提取雞全血DNA；參照GenBank收錄的雞MHC B-Lβ Ⅱ基因序列(NC-006103.2)第2外顯子信息，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成引物設(shè)計(jì)和合成，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的條帶大小為308 bp的PCR產(chǎn)物；用3 μL PCR產(chǎn)物和8 μL上樣緩沖液(980 mL/L甲酰胺，0.25 g/L溴酚藍(lán)，0.25 g/L二甲苯青，10 mmol EDTA)混勻后98 ℃水浴變性10 min，立即冰浴10 min；樣品在80 g/L非變性聚丙烯酰氨凝膠中電泳后銀染，用聚焦成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。

1.2.2 雞外周血淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 采集不同MHC B-Lβ Ⅱ基因型雞外周血2 mL，加入等體積Hank's液稀釋、搖勻，將其沿離心管壁緩緩加到4 mL淋巴細(xì)胞分離液上層，20 ℃、2 500 r/min離心30 min，用移液槍吸取離心管中的白色云霧狀細(xì)胞層。用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌上述分離得到的細(xì)胞液2次，2 500 r/min離心10 min，將淋巴細(xì)胞液重懸于2 mL含150 mL/L胎牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于41.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，1 500 r/min離心10 min，收集淋巴細(xì)胞，用含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸淋巴細(xì)胞，經(jīng)臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞存活率>95%即可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.3 不同濃度cCHMPS對TLR2抗體阻斷的雞外周血淋巴細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α、NF-κB質(zhì)量濃度的測定 用含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將分離得到的淋巴細(xì)胞稀釋成約5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取24孔培養(yǎng)板，向各孔中分別加入終濃度2、1、0.5 μg/mL的TLR2抗體共培養(yǎng)1 h后，加入終濃度200、100、50、25 μg/mL 的cCHMPS在41.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取細(xì)胞上清液，按 ELISA檢測試劑盒說明測定IL-6、TNF-α、NF-κB的質(zhì)量濃度。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS19.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)作單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以P<0.05作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MHC B-LβⅡ基因型檢測

采用PCR-SSCP方法進(jìn)行MHC B-Lβ Ⅱ基因型檢測，發(fā)現(xiàn)有5種基因型，即AA基因型、AB基因型、BB基因型、AC基因型及AD基因型。

2.2 cCHMPS對TLR2抗體阻斷的不同MHC B-LβⅡ基因型雞外周血淋巴細(xì)胞分泌IL-6的影響

在AA基因型組中，cCHMPS為25、50、100 μg/mL時(shí)，高、中、低濃度TLR2抗體組淋巴細(xì)胞中IL-6的質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)，cCHMPS為200 μg/mL時(shí)，高濃度TLR2抗體組的IL-6質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)。在AB、BB基因型組中，cCHMPS為25、50、100、200 μg/mL時(shí)，高、中、低濃度TLR2抗體組的IL-6質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)。在AC、AD基因型組中，cCHMPS為25、50、100 μg/mL時(shí)，高、中、低濃度TLR2抗體組的IL-6質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)，cCHMPS為200 μg/mL時(shí)，高、中濃度TLR2抗體組的IL-6質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)(表1)。

2.3 cCHMPS對TLR2抗體阻斷的不同MHC B-LβⅡ基因型雞外周血淋巴細(xì)胞分泌TNF-α的影響

在AA基因型組中，cCHMPS為25 μg/mL和50 μg/mL時(shí)，中，低濃度TLR2抗體組淋巴細(xì)胞中TNF-α的質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)，cCHMPS為100 μg/mL和200 μg/mL時(shí)，高濃度TLR2抗體組的TNF-α質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)。在AB基因型組中，cCHMPS為25、50、200 μg/mL時(shí)，中，低濃度TLR2抗體組的TNF-α質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)，cCHMPS為100 μg/mL時(shí)，高濃度TLR2抗體組的TNF-α質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)。在BB基因型組中，cCHMPS為25 μg/mL時(shí)，高濃度TLR2抗體組的TNF-α質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)，cCHMPS為100 μg/mL時(shí)，高、中濃度TLR2抗體組的TNF-α質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)。在AD基因型組中，cCHMPS為25、50、100、200 μg/mL時(shí)，高、中、濃度TLR2抗體組的TNF-α質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)(表2)。

表1 不同MHC B-LβⅡ基因型雞淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6的質(zhì)量濃度

注：同一基因型組中，同列數(shù)據(jù)中肩標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Notes：In the same genotype and same column,data with the same letters indicate no significant difference (P>0.05),and with different letters indicate significant difference (P<0.05).

2.4 cCHMPS對TLR2抗體阻斷的不同MHC B-LβⅡ基因型雞外周血淋巴細(xì)胞分泌NF-κB的影響

在AA、AB、BB、AC和AD基因型組中，cCHMPS為25 、50、100、200 μg/mL時(shí)，高、中、低濃度TLR2抗體組的NF-κB質(zhì)量濃度均顯著低于空白對照組(P<0.05)(表3)。

3 討論

Toll樣受體(Toll-like recepto rs，TLRs)是近年來備受關(guān)注的一種模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，主要在免疫效應(yīng)細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)和B細(xì)胞中表達(dá)，能夠識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMP)，從而啟動天然和獲得性免疫應(yīng)答[4]，是家畜天然免疫相關(guān)分子家族中的重要組成部分[5]。TLR2是Toll樣受體家族的主要成員之一[6]，也是Toll樣受體家族中識別最多不同PAMP的成員之一，是癌癥、敗血病、自身免疫疾病等多種疾病的新靶點(diǎn)[7]。TLRs廣泛分布于各種組織中，并具有細(xì)胞特異性。Iqpal M等[8]研究了雞TLRs在機(jī)體不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)雞TLR2的表達(dá)譜相對較窄，主要于脾臟、盲腸扁桃體法氏囊等執(zhí)行免疫功能的相關(guān)組織中，在B細(xì)胞、CD4+、CD8+等免疫細(xì)胞中均有中度表達(dá)。本研究將TLR2抗體加入到雞外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中共培養(yǎng)1 h后，加入不同濃度的一定純度中藥復(fù)方多糖后發(fā)現(xiàn)，與無抗體的細(xì)胞培養(yǎng)液相比，TLR2抗體在不同程度上抑制了淋巴細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α和NF-κB，這提示TLR2可能是中藥復(fù)方多糖參與免疫調(diào)節(jié)作用的受體之一。

表2 不同MHC B-LβⅡ基因型雞淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的質(zhì)量濃度

注：同一基因型組中，同列數(shù)據(jù)中肩標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Notes：In the same genotype and same column,data with the same letters indicate no significant difference (P>0.05),and with different letters indicate significant difference (P<0.05).

NF-κB 作為一種重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，能調(diào)節(jié)許多與免疫功能和炎癥相關(guān)的基因，與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、病毒感染等多種生理病理過程均有關(guān)聯(lián)。有研究表明中藥多糖能夠通過活化TLR2/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的信號分子，誘導(dǎo)免疫信號的發(fā)生[9-10]。其機(jī)制可能是多糖與相應(yīng)受體結(jié)合后，TLR2被活化，激活受體相關(guān)激酶，從而活化NF-κB，導(dǎo)致后續(xù)細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄與翻譯，引發(fā)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)[11]。IL-6由多種細(xì)胞合成，能夠促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化并產(chǎn)生抗體，刺激T細(xì)胞生成。在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)IL-6可促進(jìn)T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞等細(xì)胞活性，與機(jī)體免疫密切相關(guān)。TNF-α是一種生物學(xué)活性比較廣泛的細(xì)胞因子，它能夠抑制或直接殺死腫瘤細(xì)胞，并具有一定的促進(jìn)細(xì)胞分化和增殖的作用[12]。武劍[13]的研究表明BPS多糖能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-6的水平，LPS能顯著提高巨噬細(xì)胞IL-6和TNF-α分泌量。本次研究中，在含有TLR2抗體的雞外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中加入cCHMPS后，cCHMPS對淋巴細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α和NF-κB的促進(jìn)作用受到抑制，且隨著抗體濃度的增加，其抑制作用顯著增強(qiáng)。

表3 不同MHC B-LβⅡ基因型雞淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NF-κB的質(zhì)量濃度

注：同一基因型組中，同列數(shù)據(jù)中肩標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Notes：In the same genotype and same column,data with the same letters indicate no significant difference (P>0.05),and with different letters indicate significant difference (P<0.05).

在本次試驗(yàn)中，cCHMPS組和高、中、低濃度TLR2抗體組中，不同MHC B-LβⅡ基因型雞淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α和NF-κB的質(zhì)量濃度不同，整體而言，AA和AB基因型的各項(xiàng)免疫指標(biāo)高于其他基因型，其原因可能是多糖被MHCⅡ類分子處理并呈遞給T細(xì)胞的TCR識別，由于MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性的存在，影響了中藥多糖與TCR受體的識別和結(jié)合，阻礙了TLR2的活化，進(jìn)而導(dǎo)致不同MHC B-LβⅡ基因型雞淋巴細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α和活化NF-κB的水平不同。

以上結(jié)果說明，TLR2是中藥復(fù)方多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的受體之一，中藥復(fù)方多糖通過與淋巴細(xì)胞表面TLR2結(jié)合，經(jīng)TLR2/NF-κB信號通路活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，調(diào)控細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的合成，促進(jìn)IL-6、TNF-α的分泌。

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