張振江，杜毅超，任鵬飛，陸晨陽，霍孔林，唐海波，劉金鳳，吳健敏*

(1.廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530004；2.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001)

鏈球菌(Streptococcus)可感染人、豬、牛、羊等，是一種重要的人畜共患病病原體，其主要傳播方式為經(jīng)口或呼吸道傳播，也可垂直傳播。豬鏈球菌(Streptococcussuis)是一種革蘭陽性菌，對任何品種、年齡及性別的豬均易感[1]，可引起腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性漿膜炎、敗血癥、肺炎和猝死等[2]。目前，鏈球菌有35種血清型，其中1、2、7、9型是豬的主要致病菌，以2型流行最廣，致病性最強，其次為7型和9型。致病性豬鏈球菌主要的毒力因子有莢膜多糖(capsular polysaeeharide,CPS)、溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein,MRP)、胞外蛋白因子( extracellular protein factor,EF)、溶血素(suilysin,Sly)、谷氨酸脫氫酶(glutamic acid dehydrogenase,GDH)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白( fibronectin-and fibrinogen-binding protein，F(xiàn)BPS)和毒力相關(guān)基因(orf2)等，我國目前流行的2型強毒株是同時具有上述7種毒力基因的高致病性菌株[2]。

2016年10月初，廣西玉林某豬場保育豬突然采食下降或廢絕，精神萎靡，隨后10多頭豬死亡，大部分為中等膘情豬。為確診疫情，本實驗室對送檢死豬進行剖檢，然后進行細菌分離鑒定、藥敏試驗及致病性、毒力因子、耐藥性檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 廣西玉林市某豬場45日齡病死仔豬的病料。

1.1.2 主要試劑 普通營養(yǎng)肉湯，北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；細菌微量生化管、藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；電泳凝膠回收試劑盒，北京康為世紀公司產(chǎn)品；DNA Ladder Marker、PCR Mix，TaKaRa公司產(chǎn)品；血瓊脂培養(yǎng)基(50 mL/L山羊血),廣西獸醫(yī)研究所按常規(guī)方法配制；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.1.3 實驗動物 昆明小鼠16只，體重20 g±2 g，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與純化 病死豬剖檢特征為腦膜充血和出血，關(guān)節(jié)腫脹并有積液，脾腫大呈深紅色和邊緣出現(xiàn)褐色梗死區(qū)域。無菌取病豬的心、腦、脾臟制成勻漿，與關(guān)節(jié)液一起分別劃線接種血瓊脂平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落顏色和形態(tài)特征，并挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌落進行革蘭染色、鏡檢及純化，并將菌種接種于營養(yǎng)肉湯中備用。

1.2.2 生化試驗 將分離純化的菌株接種于山梨醇、水楊素、β半乳糖苷、馬尿酸鹽、七葉苷、甘露醇、松三糖、乳糖、核糖、甘露糖、棉籽糖、山露醇、阿拉伯糖、精氨酸雙水解酶和精氨酸脫羥酶等細菌生化反應(yīng)管，按說明書進行操作，依據(jù)伯杰細菌鑒定手冊對各生理生化反應(yīng)結(jié)果進行判定[3]。

1.2.3 16 S rDNA序列測定及分析 按常規(guī)方法提取菌株的基因組DNA并作為模板，參照文獻[4]合成16 S rDNA基因通用引物進行PCR擴增。引物序列為：PF：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；PR：5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3′；回收PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果用BLAST進行同源性比對，選取同源性較高的部分菌株16 S rDNA參考序列(表1)，用MEGA 6.0軟件中Neighbor-Joing(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行遺傳進化分析。

表1 參考序列

1.2.4 PCR分型檢測 用已提取的基因組DNA為模板，參照文獻[5-6]根據(jù)豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖cps基因的特異性設(shè)計引物，用于豬鏈球菌1、2、7、9型的鑒定(表2)。PCR反應(yīng)體系為25 μL，分別為PCR Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、引物各0.5 μL、模板DNA 2 μL，各種引物的退火溫度參照表2，退火時間為45 s。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進行電泳并記錄結(jié)果。

表2 豬鏈球菌鑒定所用引物

1.2.5 藥敏試驗及耐藥基因檢測 藥敏試驗根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards lnstitute,CLSI)所推薦的Kirly-Baue紙片擴散法[7-10]進行，判定分離菌株對藥物的敏感性。

耐藥基因檢測參照文獻[4]用PCR進行，檢測頭孢菌素類、大環(huán)內(nèi)脂類、青霉素類、氨基糖苷類、氯霉素類、喹諾酮類、四環(huán)素類及磺胺類藥物耐藥基因的共8大類18種耐藥基因的存在情況。

1.2.6 毒力因子的測定 參照文獻[2,11]選擇豬鏈球菌的主要毒力因子溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、莢膜多糖基因(cps)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(FBPS)、溶血素(Sly)及毒力相關(guān)序列(orf2)設(shè)計引物(表3)，進行PCR檢測。反應(yīng)體系為25 μL，包括PCR Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、引物各0.5 μL、模板DNA 2 μL，各種引物的退火溫度參照表3。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進行電泳并記錄結(jié)果。

1.2.7 小鼠致病性試驗 將分離菌株接種普通營養(yǎng)肉湯，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，進行細菌計數(shù)。然后將16只昆明小鼠隨機分為4組，每組4只，1組～3組分別通過腹腔注射稀釋梯度為原液、10-1、10-2的細菌稀釋液，0.3 mL/只。第4組每只腹腔注射等量的生理鹽水，連續(xù)觀察1周，觀察小鼠發(fā)病及死亡情況，分析分離菌株的致病性。

表3 毒力基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 分離菌的形態(tài)特征

將病豬的心、腦、脾臟勻漿和關(guān)節(jié)液分別劃線接種于血瓊脂平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板，經(jīng)培養(yǎng)在血瓊脂平板上生長出針尖大小、灰白透明、表面光滑的圓形菌落。將分離菌純化后染色、鏡檢觀察為革蘭陽性菌，并以多個圓形或卵圓形構(gòu)成的短鏈形式存在(圖1)。

圖1 分離菌革蘭染色觀察 (100×)

2.2 生化特性的鑒定

將純化后分離菌分別進行生化檢測，結(jié)果分離菌株糖、醇發(fā)酵能力及各種生化鑒定結(jié)果均與豬鏈球菌(Streptococcussuis)生化特性完全一致(表4)。

2.3 16 S rDNA序列鑒定和進化樹分析

以分離菌株DNA為模板，采用16 S rDNA通用引物進行PCR擴增，獲得大小約1.3 kb片段，經(jīng)BLAST比對，與豬鏈球菌序列GZ0565(CP017142)同源性高達99.9%，進一步與GenBank中豬鏈球菌的16 S rDNA序列進行比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，結(jié)合分離菌株的形態(tài)特征及生理生化特性，確定分離株為豬鏈球菌，并命名為StreptococcussuisYL1689。

表4 分離株的生理生化特征

注：+.陽性;-.陰性。

Note: +.Positive； -.Negative.

2.4 豬鏈球菌的分型鑒定

以豬鏈球菌的分型特異引物來進行PCR擴增，結(jié)果豬鏈球菌1、2、7型均未擴出目的條帶，但豬鏈球菌9型擴增出目的條帶，表明該分離株為豬鏈球菌9型(圖3)。

2.5 藥敏試驗和耐藥基因的測定

分離菌藥敏試驗和耐藥基因檢測結(jié)果見表5。由表5可見，YL1689菌株對呋喃妥因、環(huán)丙沙星、頭孢哌丁等11種藥物高度敏感，對頭孢西丁、鏈霉素、萬古霉素等3種藥物中度敏感，對苯唑西林、氨曲南、卡那霉素、復方新諾明、多黏菌素B、林可霉素等8種藥物完全耐藥。在8大類18種耐藥基因中tetO(四環(huán)素類)、aph-(3)-lia(氨基糖苷類)、SulⅢ(磺胺類)、parC(喹諾酮類)檢測結(jié)果為陽性，藥敏試驗和耐藥基因的檢測結(jié)果基本符合。

圖2 分離菌16 S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

M.DNA 標準DL 1 500;1.1型；2. 2型；3. 7型；4. 9型；5.空白對照

M.DNA Marker DL 1 500;1.Type 1;2.Type 2;3.Type 7;4.Type 9;5.Blank control

圖3豬鏈球菌1、2、7、9型的PCR鑒定

Fig.3 PCR identification ofStreptococcussuistypes 1,2,7,9

2.6 毒力基因的測定結(jié)果

以PCR的方法測定YL1689菌株的毒力基因。結(jié)果cps9H、orf2、gdh、fdps為陽性，epf、sly、mrp為陰性(圖4)。由此可見,YL1689菌株毒力基因表型為cps9H+gdh+fdps+epf-sly-mrp-orf2+。

2.7 小鼠致病性試驗

將YL1689菌株接種普通營養(yǎng)肉湯，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h 后，細菌計數(shù)為2×108CFU/mL，攻毒24 h后小鼠開始發(fā)病，表現(xiàn)為精神萎靡，食欲不振，四肢痙攣導致全身顫抖，注射原液的小鼠72 h內(nèi)全部死亡，其他攻毒組7 d后逐漸恢復精神狀態(tài)，又持續(xù)觀察數(shù)天未見死亡，對照組7 d內(nèi)未見異常。將死亡小鼠剖檢，發(fā)現(xiàn)其脾臟、腎臟、肝臟出血腫大，胸腔及腦有積液，無菌接種于50 mL/L羊血瓊脂培養(yǎng)基上，形態(tài)特征一致，PCR檢測鑒定為豬鏈球菌。

3 討論

本試驗從患病豬體內(nèi)分離到1株病原菌，經(jīng)形態(tài)學觀察和生理生化鑒定確定該菌株為鏈球菌科、鏈球菌屬。16 S rDNA測序及BLAST比對結(jié)果顯示,該病原菌為豬鏈球菌。通過PCR對莢膜多糖(cps)基因的檢測證明該菌株為豬鏈球菌9型。在小鼠致病性試驗中，參照Wei Z G等[12]的方法進行毒力判定,結(jié)果注射5×108CFU/只劑量組，半數(shù)(含)以上死亡的判為強毒(HV)；注射3×109CFU/只劑量組，半數(shù)(含)以上死亡的，5×108CFU/只劑量組，半數(shù)(不含)以上未死亡的，判為中等毒力(MV)；3×109CFU/只劑量組，半數(shù)(不含)以上未死亡的，判為低毒力(LV)。本試驗以2×108CFU/mL，0.3 mL/只(實際注射量為6×107CFU/只)對小鼠進行腹腔注射，就可以致小鼠100%死亡，據(jù)此可以判定本試驗分離的豬鏈球菌為強毒株。因此，可以診斷此次疫情是豬群感染了豬鏈球菌血清9型強毒株引起的。

從藥敏試驗及耐藥基因檢測結(jié)果來看，本試驗分離的豬鏈球菌對苯唑西林、氨曲南、復方新諾明、林可霉素、米諾環(huán)素、多黏菌素B等藥物完全耐藥，對頭孢西丁、鏈霉素、萬古霉素等3種藥物中度敏感。在耐藥基因測定時也檢出存在tetO(四環(huán)素類)、aph-(3)-lia(氨基糖苷類)、SulⅢ(磺胺類)耐藥基因，與該菌株的耐藥譜基本一致。由于該菌株對苯唑西林完全耐藥，對萬古霉素敏感性降低與人醫(yī)臨床上的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)類似，常表現(xiàn)為多重耐藥應(yīng)引起高度重視。相關(guān)的報道也顯示近年來血清9型豬鏈球菌在國內(nèi)的分離率也呈上升趨勢[11]，而本試驗發(fā)現(xiàn)一株具多重耐藥的9型鏈球菌菌株，因此加強對9型豬鏈球菌及其耐藥性的監(jiān)測十分必要。

表5 分離株的藥敏試驗及耐藥基因檢測結(jié)果

注：S.高敏(d>15 mm)； I.中敏(10 mm≤d≤15 mm)； R.低敏或不敏感(0 mm≤d<10 mm)； +陽性； -.陰性。

Note: S.High sensitivity(d>15 mm)；I.Moderate sensitivity(10 mm≤d≤15 mm)； R.Low or no sensitivity(0 mm≤d<10 mm);+.Positive;-.Negative.

M.DNA 標準DL 1 500;1.cps9h；2.epf；3.siy；4.orf2；5.mrp；6.gdh；7.fdps

M.DNA Marker DL 1 500;1.cps9h；2.epf；3.siy；4.orf2；5.mrp；6.gdh；7.fdps

圖4分離菌株毒力基因檢測結(jié)果

Fig.4 Detection of virulence genes in isolated strains

相關(guān)研究表明,豬鏈球菌的主要毒力因子有7種，在致病性菌株中毒力基因mrp和epf有很高的檢測率，而非致病菌株中檢出率極少，作為判斷致病性的指標之一[13-14]，歐美等國家認為致病性最強的基因型為cps+epf+mrp+sly+。修福曉[15]在研究豬鏈球菌9型毒力基因時發(fā)現(xiàn)7株國內(nèi)分離株均具有cps9H、gdh、fdps，缺失sly、epf，而由豬腦脊髓液分離株orf2為陽性，其他健康豬扁桃體分離株缺失orf2。本試驗分離株YL1689毒力基因為cps9H+gdh+fdps+epf-sly-mrp-orf2+，與所報道的豬腦脊髓液分離株毒力基因型基本相同。本分離株雖然缺失致病性最強的epf、mrp、sly毒力基因，但在小鼠致病性試驗中亦表現(xiàn)很強的致病力，且該菌株還能引起豬的腦膜炎，因此對豬鏈球菌9型致病機理的研究仍需進一步加強。

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