肖 麗，叢 鋒，劉向楠，李秀珍，饒 丹，練月曉，黃碧洪，張 鈺，黃 韌，郭鵬舉，陳梅麗

( 廣東省實驗動物監(jiān)測所/廣東省實驗動物重點實驗室，廣東廣州 510663)

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)屬于α皰疹病毒屬，豬是偽狂犬病病毒的天然宿主、 貯存者和傳播者[1-2]。感染豬的臨床癥狀及病死率主要取決于宿主的年齡和所涉及的病毒株的毒力，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。而豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)為動脈炎病毒屬，能使豬發(fā)生繁殖和呼吸障礙有關(guān)的傳染性疾病。該病毒首先在1987年發(fā)現(xiàn)于美國。從2006年起，我國國內(nèi)開始暴發(fā)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，并引起大量豬死亡[3-4]。 液相芯片技術(shù)是一項新的快速高通量檢測技術(shù)，該技術(shù)集流式細胞技術(shù)、熒光編碼微球、激光、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)的生化技術(shù)于一體，是一種多功能的分析平臺[5-6]。因此，不斷探索出更快更好的針對這兩種病原抗體的檢測方法，有重要的實際意義。

本文擬建立一種利用液相芯片技術(shù)同步檢測豬偽狂犬病病毒抗體和豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的方法，所用蛋白抗原均來自于原核表達的蛋白，分別是PRRSV N蛋白和PRV gE蛋白，所建立的雙重檢測PRRSV和PRV抗體液相芯片方法，可以應(yīng)用于豬病臨床檢測和流行病學(xué)調(diào)查等。

1 材料與方法

1.1 材料

PRV gE蛋白和PRRSV N蛋白，本實驗室表達和純化，并于-20℃保存；熒光磁性納米微球、微球偶聯(lián)試劑盒，美國Luminex公司產(chǎn)品；生物素標記的羊抗豬二抗，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；藻紅蛋白標記的鏈霉親和素(SAPE)，Invitrogen公司產(chǎn)品；稀釋液和洗液均為PBS+10 g/L BSA；16份健康豬血清及臨床血清由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院馬靜云教授惠贈；PRV gE蛋白ELISA檢測試劑盒，CIVtest公司和INgezim公司產(chǎn)品；PRRSV ELISA試劑盒，INgezim公司和BIOCHEK公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗原偶聯(lián)微球 按照微球偶聯(lián)試劑盒說明書進行。在相同微球數(shù)量下，通過偶聯(lián)不同蛋白抗原量，來優(yōu)化蛋白抗原偶聯(lián)微球量。

1.2.2 抗原偶聯(lián)微球效果驗證 微球稀釋成50個/μL，50 μL/孔加入96孔板，設(shè)置3個重復(fù)；陽性血清與陰性血清分別按1∶25～1∶3 200稀釋，50 μL/孔，以稀釋液為空白對照，混勻后室溫振搖1 h；洗液洗3遍，然后加入稀釋成1∶1 000的生物素標記的羊抗豬二抗50 μL/孔，室溫振搖30 min；洗滌3遍后，加入1∶100稀釋的SAPE 50 μL/孔，室溫振搖30 min；洗3遍后加入50 μL/孔洗液,上機讀MFI值。有效判定標準：當平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)的陽性與陰性比值大于3，且空白對照小于300，說明該蛋白偶聯(lián)微球有效。

1.2.3 單一液相芯片檢測 操作方法同1.2.2。唯一區(qū)別就是將不同稀釋度下的相同血清樣品換成一定稀釋度下的不同血清樣品。

1.2.4 特異性驗證 檢測兩個蛋白抗原偶聯(lián)的微球與其他豬病病原，包括豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus Ⅱ,PCV2)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV))的血清樣品之間有無交叉反應(yīng)；具體操作方法同 1.2.2。同時，這2個病原之間有無交叉反應(yīng)也要進行驗證，具體操作方法也同 1.2.2。之所以選擇豬病的這3種病原(PCV2、CSFV、PPV)進行特異性試驗，是因為這3種病原和PRRSV及PRV都屬于豬的免疫抑制病病原，臨床癥狀相似，在豬病病原檢測中進行相互區(qū)分很有必要。

1.2.5 單一液相芯片法的抗體檢測和ELISA試劑盒靈敏度對比 將相同血清按2倍比稀釋，分別進行相應(yīng)液相芯片法檢測和ELISA試劑盒檢測。對比兩種方法的陽性檢出對應(yīng)的最大稀釋度。血清稀釋度最小從1∶25開始，液相芯片法稀釋液為PBS+10 g/L BSA，而ELISA試劑盒的稀釋液使用ELISA試劑盒配備的樣品稀釋液。

1.2.6 雙重液相芯片法的抗體檢測及樣品檢測 在檢測稀釋液(PBS+10 g/L BSA)中分別將兩種微球稀釋成50個/μL；每孔加入50 μL，使兩種微球每孔均為2 500個；之后操作同1.2.2。樣品檢測試驗中，樣品來源于其他實驗室贈送。

1.2.7 陽性判定標準 對16份健康豬血清同時進行豬偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的液相芯片法檢測。將這16份豬健康血清按1∶800稀釋，之后具體操作方法同1.2.2。然后分別將讀取的MFI值的平均值加上3倍標準差之和作為判定閾值，若樣品血清的MFI值大于判定閾值，則該樣品判定為陽性，若樣品血清的MFI值小于判定閾值，則該樣品判定為陰性。

2 結(jié)果

2.1 蛋白抗原偶聯(lián)微球量優(yōu)化

每2.5×105個微球偶聯(lián)PRV GE蛋白2.5、5.0、10.0、20.0 μg，檢測不同蛋白抗原偶聯(lián)微球量對MFI值影響(同一份血清，稀釋度均為1∶25)，檢測方法按照1.2.2進行(圖1)。結(jié)果表明，在相同檢測條件下， 每2.5×105個微球偶聯(lián)PRV GE蛋白2.5 μg時，MFI值已經(jīng)最大，所以PRV GE蛋白的最佳蛋白抗原偶聯(lián)微球量為2.5 μg。同樣，按每2.5×105個微球偶聯(lián) PRRSV N蛋白0.8、2.0、8.0、15.0 μg，檢測方法按照1.2.2進行，每個偶聯(lián)量對應(yīng)的檢測血清稀釋度為1∶25(在此試驗中所用的PRRSV陽性樣品來自臨床ELSIA陽性，且為同一份血清樣品)，驗證不同蛋白抗原偶聯(lián)微球量對MFI值的影響(圖2)。結(jié)果表明，PRRSV N蛋白的最佳蛋白抗原偶聯(lián)微球量為8.0 μg。

圖1 PRV GE蛋白最佳偶聯(lián)量優(yōu)化

圖2 PRRSV N蛋白最佳偶聯(lián)量優(yōu)化

2.2 判定閾值的確定及特異性試驗結(jié)果

16份陰性豬血清1∶800稀釋(因為血清在1∶800稀釋時的P/N值最大，即陽性血清與陰性血清區(qū)分最明顯)檢測相應(yīng)兩個抗原的MFI值，并計算各自的判定閾值，計算公式為MFI值平均值加上3個標準差，計算得出判定閾值分別為：PRV 1 281.0 和PRRSV 727.12，樣品MFI值大于各自的閾值判定為陽性；特異性試驗檢測結(jié)果顯示，與其他幾種豬病病原(CSFV、 PCV、PPV)的陽性血清無交叉反應(yīng)，且兩種病原之間，相互也無交叉反應(yīng)(圖3)。

圖3 液相芯片檢測PRV和PRRSV血清的特異性

2.3 單一體系X-MAP法與ELISA的靈敏度比較

分別就同一份陽性血清按照2倍比梯度稀釋，分別進行X-MAP法及ELISA檢測，比較最大檢出稀釋倍數(shù)(圖4和表1)。 結(jié)果表明，檢出PRV抗體的X-MAP稀釋倍數(shù)是相應(yīng)ELISA的66倍，而檢出PRRSV抗體的X-MAP稀釋倍數(shù)是相應(yīng)ELISA的32倍。

圖4 液相芯片檢測PRRSV和PRV抗體的靈敏度

血清Serum最低檢測限LowestdetectablelimitELISA液相芯片分析系統(tǒng)LuminexPRV<1/1001/3200PRRSV8001/52800

2.4 液相芯片技術(shù)同步檢測豬血清樣本中PRRSV抗體和PRV抗體

利用雙重X-MAP法檢測同步檢測50份豬臨床血清。在50份豬血清樣品中，用ELISA試劑盒檢測出PRRSV抗體陽性樣品41個，陰性樣品9個。41個ELISA陽性樣品中，X-MAP檢測也均為陽性；而9個ELISA陰性樣品中有2個X-MAP陽性，這也證明了X-MAP法比ELISA法靈敏度更高。另外，還用了另一商品化的ELISA試劑盒對樣品復(fù)檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前ELISA陽性樣品仍然為陽性，而9份前ELISA陰性樣品中檢出5份陽性，說明后一品牌的ELISA試劑盒(INgeZim)靈敏度更高。同樣，在這50份豬血清樣品中用ELISA檢測出PRV抗體陽性樣品為7個，陰性樣品43個；并且在7個ELISA陽性樣品中，X-MAP陽性只有3個，這可能是因為陽性樣品基數(shù)太少導(dǎo)致的誤差，也可能與ELISA試劑盒的檢測誤差有關(guān)；在43個陰性樣品中，X-MAP陽性21個，陰性22個，這說明X-MAP法的靈敏度比ELISA法高66倍的試驗結(jié)果是成立的。因為在用X-MAP法檢測PRV抗體中，7個ELISA陽性樣品中，X-MAP陽性只有3個，所以為了判斷是否是ELISA試劑盒的檢測誤差導(dǎo)致的，本研究還用了不同品牌的商品化ELISA試劑盒(CIVtest)來復(fù)檢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個商品化ELISA試劑盒的符合率40/50，符合率中等，其中7份前ELISA陽性樣品中只檢出1個陽性，而43份前ELISA陰性樣品中檢出4份陽性，綜上所述，兩個ELISA試劑盒對比不明顯。但是如果把兩種ELISA結(jié)果矛盾的10份樣品去掉，剩下的40個樣品中有1個ELISA陽性樣品，且X-MAP法檢測也為陽性。在其余39份ELISA陰性樣品中，X-MAP檢測出21份陽性，18份陰性，也說明X-MAP法的靈敏度比ELISA高。

3 討論

目前，PRRSV抗體和PRV抗體檢測技術(shù)包括血清中和試驗(serum neutralization test，SN)、免疫過氧化物酶單層試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等，其中ELISA被廣泛應(yīng)用[7-9]。但是ELISA不能同步檢測多種病原，且特異性不強，而液相芯片技術(shù)作為一種新的用于檢測病原抗體的技術(shù)，優(yōu)點主要是可以同時檢測多種病原抗體，成本相對較低，而且快速和同步檢測多個樣品。

在本研究中，相同X-MAP法檢測條件下，確定了各自的最佳蛋白抗原偶聯(lián)微球量，分別為PRRSV N蛋白8.0 μg、PRV GE蛋白2.5 μg。針對該液相芯片技術(shù)，還進行了二抗-Biotin濃度對MFI值影響的探索。結(jié)果證明，當二抗-Biotin濃度范圍在4.0 μg/mL～0.5 μg/mL時，對P/N值的影響不顯著，但是對MFI值影響顯著，MFI值隨著二抗-Biotin濃度的增加而增加，當二抗-Biotin濃度從1.0 μg/mL上升到2.0 μg/mL時，MFI值顯著增加?；诖?，本研究常使用折中的2.0 μg/mL的二抗?jié)舛茸鳛楣ぷ鳚舛?，既保證了MFI值的相對較高，也對P/N值影響不顯著，也降低二抗-Biotin的用量，節(jié)約成本。同理，當二抗-Biotin濃度定為2.0 μg/mL時，SAPE濃度的變化對MFI值影響不顯著，但對P/N值影響較大。當SAPE濃度為2.5 μg/mL時，P/N值最大。所以，本研究中將SAPE濃度定為2.5 μg/mL。另外，與ELISA靈敏度比較發(fā)現(xiàn)， PRRSV的X-MAP血清稀釋倍數(shù)是相應(yīng)ELISA的32倍，而PRV的X-MAP稀釋度是相應(yīng)ELISA法的66倍。由此可見，X-MAP的靈敏度遠比ELISA高。而且特異性檢測結(jié)果顯示，與豬其他幾種病原的抗體無交叉反應(yīng)。

綜上所述，利用液相芯片技術(shù)同步檢測豬偽狂犬病病毒抗體和豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的方法具有良好的應(yīng)用價值。

參考文獻:

[1] 殷 震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997:700-713.

[2] 斯特勞B E,阿萊爾S D,蒙加林W L,等.豬病學(xué)[M].8版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2000:195-196.

[3] Tian K,Yu X,Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants：unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS One,2007,2(6):e526.

[4] Zhou L,Yang H.Porcine reproductive and respiratory syndrome in China[J].Virus Res,2010,154:31-37.

[5] Croft H,Malinowski T,Krizbai L,et al.Use of luminex MAP derived Bio-Plex bead-based suspension array for specific detection of PPVW and characterization of epitopes on the coat protein of the virus[J].J Virol Methods,2008,153(2):203-213.

[6] Ray C A,Bowsher R R,Smith W C,et al.Development validatin and implementtation of a multiplex immunoassay for the simultaneous determinatin of five cytokines in human serum[J].J Pharm Biomed Anal,2005,36(5):1037-1044.

[7] Chai Z,Ma W,Fu F,et al.A SYBR Green-based real-time RT-PCR assay for simple and rapid detection and differentiation of highly pathogenic and classical type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus circulating in China[J].Arch Virol, 2013,158(2):407-415.

[8] 官家明，施開創(chuàng)，陳漢忠,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測技術(shù)研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2013,34(8):88-92.

[9] 王莉娟，陸明哲，陳義平,等.偽狂犬病檢測技術(shù)研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2005(6):42-44.