張會軍，劉婷麗，范現(xiàn)成，林 青,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海西寧 810016)

隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)是一種重要的機會性致使人和多種動物嚴(yán)重腹瀉的腸道寄生原蟲[1]。以引起腹瀉為主要臨床特征的隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)能在人畜間傳播，嚴(yán)重危害人和動物的健康甚至導(dǎo)致幼兒和犢牛的腹瀉死亡，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。近年來，陜西省大力發(fā)展畜牧業(yè)并將其作為重點發(fā)展的產(chǎn)業(yè)之一，奶牛產(chǎn)業(yè)得到了長足的發(fā)展。但是頻繁的跨地域引種促使了人畜共患病原的擴散，對人和動物造成潛在威脅。牛感染隱孢子蟲后，糞便會污染水源和食物，通過“糞-口”途徑引起隱孢子蟲病的流行暴發(fā)[2-3]。目前，在陜西省已有牛感染安氏隱孢子蟲(C.andersoni)、牛隱孢子蟲(C.bovis)、瑞氏隱孢子蟲(C.ryanae)的相關(guān)報道[4-6]，但尚未見有關(guān)在陜西省有牛感染微小隱孢子蟲(C.parvum)的報道。

2017年5月，陜西省眉縣某奶牛場有犢牛發(fā)生嚴(yán)重腹瀉。牛場的工作人員先后飼喂了痢菌凈、卡那霉素、吡喹酮等藥物，并且給予口服補液鹽，但未取得明顯效果。為明確腹瀉犢牛是否存在隱孢子蟲感染的情況，本研究分別基于18 S rRNA和60 ku糖蛋白(60 ku glycoprotein，GP60)兩個基因位點進行隱孢子蟲的分子生物學(xué)檢測[7]，以確定致使?fàn)倥８篂a的可能原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源及牛場情況 本研究所用的3份樣品來自于某奶牛場的腹瀉犢牛。該奶牛場的犢牛(6月齡以內(nèi))出現(xiàn)劇烈腹瀉，糞便呈淡黃色牛奶狀，腹瀉犢牛食欲下降，多臥少立，精神沉郁。犢牛腹瀉發(fā)生后，牛場先后給犢牛飼喂了痢菌凈、卡那霉素、吡喹酮等藥物，期間穿插飼喂口服補液鹽，但腹瀉癥狀未取得明顯好轉(zhuǎn)。將所采集的糞便樣品裝入樣品袋內(nèi)，并詳細(xì)記錄年齡、品種、地理位置、日期等信息，放入冰袋，速回實驗室備檢。

1.1.2 試劑 糞便基因組E.Z.N.A.?DNA提取試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品；10×ExTaqbuffer(不含Mg2+)、ExTaqDNA聚合酶、r-Taq酶、2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L MgCl2、6×Loading buffer、DNA Marker DL 2 000、溴化乙錠，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖，上海英濰捷基貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 所使用的隱孢子蟲18 S rRNA和GP60基因的引物(表1)及反應(yīng)程序參照文獻[8]。引物均由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。

1.1.4 儀器設(shè)備 HC3018型臺式高速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HH-4型恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品；C-XP-D型PCR擴增儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；DYY-12型電泳儀，北京市六一儀器廠生產(chǎn)；Champ Gel 5000型紫外凝膠成像系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；AUY220型精密電子天平，上海光學(xué)儀器一廠生產(chǎn)；高壓蒸汽滅菌鍋，上海人和科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；微量移液器，北京大龍興創(chuàng)公司產(chǎn)品。

表1 隱孢子蟲套式PCR引物

1.2 方法

1.2.1 糞便基因組DNA的提取 采集糞便保存在25 g/L重鉻酸鉀中，取出50 mg～100 mg 糞樣到 1.5 mL離心管中，加入蒸餾水清洗樣品直到上清透亮，按照 E.Z.N.A.Stool DNA Kit 的說明提取糞便基因組DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 套式PCR擴增 基于18 S rRNA和GP60基因，利用套式PCR對所采集的樣品進行隱孢子蟲的檢測和蟲種鑒定。18 S rRNA和GP60基因的反應(yīng)體系如下。第1輪PCR反應(yīng)：25 μL反應(yīng)體系中包括2.5 μL 10×PCR buffer，2.0 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2.0 μL MgCl2(25 mmol/L)，10 nmol/L第1輪上、下游引物各1 μL，0.125 μL r-Taq(5 U/μL)酶，1 μL DNA模板，雙蒸水補齊至25 μL。第2輪PCR反應(yīng)除了所用模板為第1輪PCR產(chǎn)物，引物為第2輪上、下游引物外，其余試劑種類與劑量均與第1輪相同。擴增條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃(18 S F1和R1)或58℃(18 S F2和R2)或55℃(GP60)退火45 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃ 10 min，16℃結(jié)束反應(yīng)。取4 μL第2輪PCR擴增產(chǎn)物在含溴化乙錠(Ethidium Bromide，EB)的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.2.3 序列分析和基因分型命名規(guī)則 將電泳結(jié)果的第2輪PCR產(chǎn)物以及第2輪引物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，測序儀為ABI PRISM 3730 XL DNA Analyzer(Applied Biosystems，USA)。將18 S rRNA基因位點測得的序列使用軟件Clustal X 1.83進行比對并參照圖譜校正。然后將校正后的序列，運用BLAST將其與GenBank數(shù)據(jù)庫中的參考序列進行同源搜索。利用MEGA 5.1軟件進行種系發(fā)育關(guān)系分析確定每份陽性樣品所屬的隱孢子蟲種類，采用鄰接法(Neighbor-joining)、自展值為1000、Kimura 2-parameter模型，并以Plasmodiummalariae(GenBank accession number AB489194)為外群。以GP60基因作為區(qū)分C.parvum基因亞型的分子標(biāo)記，根據(jù)已明的規(guī)則，亞型以種屬和亞型家族名稱開頭，C.parvum以Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd等命名。亞型家族名稱后綴以TCA、TCG或TCT重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)，分別以A、G、T加數(shù)字表示，其他重復(fù)序列用R加數(shù)字表示[4，9-10]。

2 結(jié)果

2.1 18 S rRNA的PCR擴增結(jié)果

用18 S rRNA的基因位點對陜西眉縣某奶牛場腹瀉犢牛采集的3份糞便樣品進行DNA提取和PCR擴增，3份樣品均擴增出830 bp左右大小的目的片段(圖1)，說明3份糞便樣品中均含有隱孢子蟲。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；C.陰性對照； 1～3.糞便樣品

M.DNA Marker DL 2 000；C.Negative control；1-3.Fecal samples

圖1隱孢子蟲18 S rRNA基因PCR擴增結(jié)果

Fig.1 PCR amplication results ofC.parvum18 S rRNA

2.2 隱孢子蟲的種系發(fā)育分析

基于隱孢子蟲的18 S rRNA基因進行序列分析并構(gòu)建遺傳進化樹(圖2)。結(jié)果顯示，3份腹瀉犢牛隱孢子蟲陽性樣品中，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的C.parvum具有99%以上的序列相似性。種系發(fā)育關(guān)系分析顯示，3份樣品全部與C.parvum位于同一進化枝上，而且具有較高的節(jié)點支持值(>95%)。以上分析結(jié)果表明，本次所采集到的 3份腹瀉犢牛糞便樣品中，均含有C.parvum。

圖2 微小隱孢子蟲分離株在18 S rRNA基因位點上的種系發(fā)育關(guān)系

2.3 GP60的PCR擴增結(jié)果

使用GP60基因位點對所采集的糞便樣品進行PCR擴增，3份樣品均擴增出850 bp左右大小的目的片段(圖3)?；蚍中徒Y(jié)果表明，所采集的3份糞便樣品全部為Ⅱd型微小隱孢子蟲，且本次檢測的3份糞便樣品中，2份為ⅡdA30G4，1份為Ⅱd A34G4。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；C.陰性對照； 1～3.糞便樣品

M.DNA Marker DL 2 000；C.Negative control；1-3.Fecal samples

圖3隱孢子蟲GP60基因PCR擴增結(jié)果

Fig.3 PCR amplication result ofC.parvumGP60 gene

3 討論

在全球，養(yǎng)牛場中隱孢子蟲的分布非常普遍，但由于環(huán)境因素和人為因素的差異，其隱孢子蟲的分布情況也存在很大的不同。奶牛特別是犢牛感染隱孢子蟲的現(xiàn)象十分普遍，C.parvum是感染的主要隱孢子蟲種類之一。有研究表明，犢牛在斷奶后會有一定的應(yīng)激反應(yīng)[11-13]，而且斷奶后由于犢牛不能從母體獲得母源抗體且自身腸道菌群和消化能力尚未成熟，這就進一步增加了犢牛的感染風(fēng)險。還有研究表明，流動日益頻繁的人和其他動物也是犢牛感染隱孢子蟲的重要來源[2-3]。已有研究表明，C.parvum、C.bovis、C.andersoni和C.ryanae是牛體內(nèi)常寄生的隱孢子蟲種類。

本次使用Sulaiman I M等[14]建立的方法，使用PCR成功擴增出隱孢子蟲的18 S rRNA和GP60兩個基因的部分片段，檢測出C.parvum。這是在陜西省眉縣某牛場的調(diào)查中，首次發(fā)現(xiàn)人畜共患的Ⅱd型C.parvum，表明在該牛場中存在人畜共患病的病原——C.parvum。由于這次樣本量小且只是針對出現(xiàn)腹瀉癥狀的犢牛進行的檢測，還不能完全闡明該牛場隱孢子蟲的感染情況與隱孢子蟲病的流行情況。在以后的研究中可以進一步加大采樣量，以便對陜西省牛場的總體隱孢子蟲感染情況進行更為全面的了解，為防控隱孢子蟲病提供理論指導(dǎo)。總之，本研究結(jié)果可以說明，該牛場腹瀉犢牛存在微小隱孢子蟲感染的情況，需要加強防范意識，采取相應(yīng)的防控措施，阻斷隱孢子蟲在該地區(qū)人與牛之間的相互傳播。

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