吳 植，朱善元，顧玲玲，張繼玲，吳 萌，崔瀟婷，王安平

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州 225300)

溶菌酶(lysozyme，LYZ)又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，廣泛存在于牛奶、唾液、哺乳動(dòng)物淚水及禽類蛋白中[1]。人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)由130個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為14.7 ku[2]，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效，并且對(duì)人體完全無(wú)毒害、無(wú)副作用，在臨床和食品工業(yè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[3]。

天然hLYZ 可以從人乳、胎盤或唾液中少量提取，但來(lái)源極為有限。已有用大腸埃希菌、酵母和植物表達(dá)重組hLYZ的報(bào)道，但細(xì)菌表達(dá)的hLYZ是無(wú)活性的包涵體，真核細(xì)胞的表達(dá)水平低、成本高[4-6]。

腺聯(lián)病毒屬細(xì)小病毒科依賴病毒屬，是一種復(fù)制缺陷型單鏈DNA病毒，需要腺病毒等輔助病毒才能復(fù)制產(chǎn)生子代病毒。重組腺聯(lián)病毒(Recombinant avian adeno-associated virus,rAAAV)是目前公認(rèn)的最有前景的基因轉(zhuǎn)移載體之一，具備對(duì)宿主沒(méi)有致病性、免疫原性極低、宿主范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地用于基因治療和基因工程疫苗等方面的研究[7]。本研究利用重組禽腺聯(lián)病毒研究人溶菌酶在雞蛋清中的表達(dá)情況，為人溶菌酶的應(yīng)用研究提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌種與試驗(yàn)用動(dòng)物 含hLYZ輸卵管特異表達(dá)框的重組禽腺聯(lián)病毒(rAAAV-OVLYZ)由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；微球菌由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研組提供；邵伯蛋雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供。

1.1.2 工具酶與試劑 人溶菌酶檢測(cè)試劑盒、人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品、人溶菌酶單抗，Abcam公司產(chǎn)品；DNA Polymerase、DNase Ⅰ、Trizol RNA抽提試劑盒，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，KPL公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已發(fā)表的hLYZ基因序列(NM-000239)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，以擴(kuò)增長(zhǎng)度約為400 bp的開放閱讀框，其序列分別為：5′-GTACTCGAGATGAAGGTCTTTGAAAGGTGTG-3′and 5′-GTACTCGAGTTACACTCCACAACCTTGAACA-3′， 引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 rAAAV-OVLYZ的產(chǎn)蛋雞動(dòng)物試驗(yàn) 將制備純化好的rAAAV-OVLYZ以每只雞2×1011病毒顆粒(vector genomes，v.g.)經(jīng)翅靜脈注射5只正常產(chǎn)蛋母雞，以注射生理鹽水的正常產(chǎn)蛋母雞為對(duì)照。從注射的次日起收集雞蛋，無(wú)菌收集濃蛋清，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋清中hLYZ含量的測(cè)定 為檢測(cè)重組病毒注射后蛋清中hLYZ的表達(dá)水平，每只雞每星期收集4個(gè)～5個(gè)雞蛋，取其濃蛋清合并，參照人溶菌酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)蛋清中hLYZ的含量，分別以正常蛋清和注射生理鹽水的產(chǎn)蛋雞蛋清作為正常對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.2.4 目的基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè) 在重組病毒注射后的第12周，產(chǎn)蛋雞試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行宰殺，取其輸卵管膨大部、心、肝、脾、肺、腎、肌肉等組織，參照Trizol RNA抽提說(shuō)明書提取總RNA，用DNase Ⅰ 37℃消化15 min，去除其中可能殘余的DNA。然后參照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書，以hLYZ特異性引物進(jìn)行檢測(cè)，RT反應(yīng)體系為20 μL，包括RNA 1 μg，反向引物10 pmol ，10×緩沖液2 μL，dNTPs 10 pmol ，RNA抑制劑0.5 pmol ，反轉(zhuǎn)錄酶1 μL；反應(yīng)程序?yàn)?7℃ 60 min；50 μL PCR反應(yīng)體系包括2 μL RT產(chǎn)物、15 pmol正、反向引物，5 μL 10×緩沖液，2.5 U DNA Polymerase；35次循環(huán)的PCR程序?yàn)?5 ℃/30 s(第1次循環(huán)為4 min)、58 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s(最后1次循環(huán)為8 min)。反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 目的蛋白的Western blot檢測(cè) 取15 μL蛋清樣品，加入5×loading buffer煮沸3 min后，取15 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析，以人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，以注射重組病毒前的蛋清作為陰性對(duì)照。樣品電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以抗hLYZ單抗為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，按常規(guī)方法進(jìn)行Western blot反應(yīng)，最后用DAB顯色試劑盒顯色觀察。

1.2.6 重組蛋白的體外抑菌試驗(yàn) 采用管碟法對(duì)蛋清中重組蛋白的抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)。取15 μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微球菌菌液稀釋于150 μL滅菌水中，均勻涂布于LB瓊脂板表面，將直徑約6 mm的無(wú)菌不銹鋼小管放在平板表面，于管內(nèi)滴加100 μL 50倍稀釋的待檢蛋清，放置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，18 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 蛋清中hLYZ的表達(dá)動(dòng)態(tài)

為檢測(cè)注射病毒后蛋清中重組hLYZ的表達(dá)水平，每只雞每周收集4個(gè)～5個(gè)雞蛋，取濃蛋清用人溶菌酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其表達(dá)水平。結(jié)果顯示在注射重組病毒的第1周hLYZ的平均表達(dá)量可達(dá)25.8 μg/mL，在第5周達(dá)到最高68.3 μg/mL，然后慢慢降至32.6 μg/mL，表達(dá)時(shí)間持續(xù)3個(gè)月之久(圖1)。

2.2 目的基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)

為了檢測(cè)rAAAV-OVLYZ介導(dǎo)的外源基因的表達(dá)是否具有良好的組織特異性，提取注射重組病毒雞和不注射重組病毒雞不同組織總RNA，以針對(duì)hLYZ開放閱讀框的特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示只在注射重組病毒后雞的輸卵管膨大部組織中擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異性條帶，在其他組織中及未注射重組病毒雞的各組織中均未擴(kuò)增出目的條帶(圖2)。

圖1 rAAAV-OVLYZ注射雞蛋清中hLYZ的表達(dá)動(dòng)態(tài)

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～7.重組病毒注射雞的輸卵管(膨大部)、心、肝、脾、肺、腎、肌肉; 8.陰性對(duì)照

M.DNA marker DL 2 000; 1-7.oviduct，heart，liver，spleen，lung，kidney，muscle of rAAAV-injected hens; 8.Negative control

圖2重組病毒注射后雞組織中hLYZ基因的RT-PCR檢測(cè)

Fig.2 Transcription of hLYZ gene in tissues of rAAAV-OVLYZ injected laying hens

2.3 重組蛋白的Western blot檢測(cè)

為檢測(cè)重組蛋白的大小，以人溶菌酶單抗為一抗，HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，對(duì)樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示在14.7 ku處有特異性條帶，而在未注射重組病毒的蛋清中未撿到目的條帶(圖3)。

2.4 重組蛋白的體外抑菌活性

選取工程菌微球菌為檢測(cè)菌，在細(xì)菌平板上分別加入稀釋后的重組蛋清，hLYZ活性檢測(cè)結(jié)果顯示，注射重組病毒蛋清的抑菌圈明顯大于正常蛋清的抑菌圈(圖4)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.hLYZ標(biāo)準(zhǔn)品；2.含重組LYZ的蛋清；3.空白對(duì)照

M.Protein molecular weight Marker；1.The hLYZ standard; 2.The egg whites with recombinant LYZ; 3.Negative control

圖3重組蛋白LYZ的Western blot檢測(cè)

Fig.3 Western blot analysis of recombinant protein LYZ

A、B.待檢蛋清; C.正常蛋清; D.無(wú)菌PBS

A,B.the pooled egg whites of 5 hens; C.The normal egg white; D.The sterile PBS

圖4人溶菌酶的抑菌活性測(cè)定

Fig.4 Determination of antibacterial activity of hLYZ

3 討論

雞輸卵管生物反應(yīng)器是一種極具吸引力的生產(chǎn)重組蛋白的新平臺(tái)，在生物制藥業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景，已有成功培育出表達(dá)干擾素、促紅細(xì)胞生成素、人生長(zhǎng)因子等的轉(zhuǎn)基因雞的報(bào)道，但轉(zhuǎn)基因雞的培育存在操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn)[8-10]。因此，將外源蛋白在雞輸卵管上皮細(xì)胞中進(jìn)行暫態(tài)表達(dá)不失為一個(gè)好的選擇。高波等[11]利用含有輸卵管特異性啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒建立了雞輸卵管暫態(tài)表達(dá)體系，雖然這種方法操作簡(jiǎn)單、成本較低，但存在表達(dá)水平較低、表達(dá)時(shí)間短的弊端。

重組禽腺聯(lián)病毒已被證實(shí)是一種良好的基因轉(zhuǎn)移載體，能介導(dǎo)外源基因在體外進(jìn)行高水平、長(zhǎng)時(shí)效的表達(dá)。Perozo F等[12-13]以重組AAAV為載體分別構(gòu)建了表達(dá)NDV和IBDV保護(hù)性抗原的基因工程疫苗，取得了良好的保護(hù)效果，Wang Y J等[14]將RNA技術(shù)與rAAAV載體相結(jié)合，結(jié)果顯示rAAAV能介導(dǎo)miRNA的表達(dá)，并能在細(xì)胞水平和雞胚水平充分抑制雞法氏囊病毒的復(fù)制。筆者在前期研究中，用三質(zhì)粒法制備的rAAAV可介導(dǎo)人組織激肽釋放酶在蛋清中高效特異表達(dá)6周[15]。

本研究用含hLYZ輸卵管特異表達(dá)框的重組禽腺聯(lián)病毒翅靜脈注射產(chǎn)蛋母雞，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示重組病毒能介導(dǎo)目的基因在輸卵管上皮組織特異表達(dá)，而在其他組織中未檢測(cè)到目的基因表達(dá)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示重組蛋白大小與預(yù)期一致。抑菌活性檢測(cè)也表明注射了重組病毒的重組蛋清的抑菌活性明顯優(yōu)于正常蛋清的。表達(dá)動(dòng)態(tài)水平檢測(cè)結(jié)果顯示，第1周即可檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)，第五周時(shí)表達(dá)水平達(dá)最高68.3 μg/mL，然后慢慢降至32.6 μg/mL，表達(dá)時(shí)間持續(xù)3個(gè)月之久。Cao D N等[16]利用慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因雞表達(dá)人溶菌酶，G1代表達(dá)水平約為57.66 μg/mL。朱秋菊等[17]報(bào)道利用表達(dá)人溶菌酶的重組質(zhì)粒注射產(chǎn)蛋雞，表達(dá)水平約維持10 d。本研究利用重組禽腺聯(lián)病毒表達(dá)的人溶菌酶水平與轉(zhuǎn)基因雞水平相當(dāng)，與質(zhì)粒介導(dǎo)的人溶菌酶表達(dá)時(shí)間僅為10 d相比，重組病毒一次注射目的蛋白表達(dá)時(shí)間可維持約3個(gè)月之久。后續(xù)試驗(yàn)，筆者將嘗試采用重復(fù)注射的方式以繼續(xù)提高蛋清中人溶菌酶的濃度并延長(zhǎng)其表達(dá)時(shí)間。

參考文獻(xiàn):

[1] May K D,Wells J E,Maxwell C V,et al.Granulated lysozyme as an alternative to antibiotics improves growth performance and small intestinal morphology of 10-day-old pigs[J].J Anim Sci,2012,90:1118-1125.

[2] 孫懷昌,張 泉,施偉慶,等.人溶菌酶cDNA的克隆及其在小鼠體內(nèi)的表達(dá)[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,24(2):157.

[3] Yang B,Wang J,Tang B,et al.Characterization of bioactive recombinant human lysozyme expressed in milk of cloned transgenic cattle[J].PLoS One,2011,6(3):e17593.

[4] Lu D,Liu S,Shang S Z,et al.Production of transgenic-cloned pigs expressing large quantities of recombinant human lysozyme in milk[J].PLoS One,2015,10(5):e0123551.

[5] Iwata T,Tanaka R,Suetsugu M,et al.Efficient secretion of human lysozyme from the yeast,Kluyveromyceslactis[J].Biotechnol Lett,2004,26(23):1803-1808.

[6] Wu H Y,Cao D N,Liu T X,et al.Purification and characterization of recombinant human lysozyme from eggs of transgenic chickens[J].PLoS One,2015,10(2):e0146032.

[7] Daso M F,Tomkowicz B,Perry W L,et al.Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy[J].Biodrugs,2017,31(4):317-334.

[8] Liu T,Wu H,Cao D,et al.Oviduct-specific expression of human neutrophil defensin 4 in lentivirally generated transgenic chickens[J].PLoS One ,2015,10(5):e0127922.

[9] Park T S,Lee H G,Moon J K,et al.Deposition of bioactive human epidermal growth factor in the egg white of transgenic hens using an oviduct-specific minisynthetic promoter[J].FASEB J,2015,29(6):2386-2396.

[10] Lee S H,Gupta M K,Ho Y T,et al.Transgenic chickens expressing human urokinase-type plasminogen activator[J].Poult Sci,2013,92(9):2396-2403.

[11] Gao B,Sun H C,Fang H X,et al.Expression and preliminary characterization of recombinant human tissue kallikrein in egg white of laying hens[J].Poult Sci,2006,85:1239-1244.

[12] Perozo F,Villegas P,Estevez C,et al.Protection against infectious bursal disease virulent challenge conferred by a recombinant avian adeno-associated virus vaccine[J].Avian Dis,2008,52(2):315-319.

[13] Perozo F,Villegas P,Estevez C,et al.Avian adeno-associated virus-based expression of Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase protein for poultry vaccination[J].Avian Dis,2008,52(2):253-259.

[14] Wang Y J,Sun H C,Shen P P,et al.Effective inhibition of infectious bursal disease virus replication by recombinant avian adeno-associated virus-delivered microRNAs[J].J Gen Virol,2009,90(6):1417-1422.

[15] Wang A P,Sun H C,Wang J Y,et al.Recombinant avian adeno-associated virus-mediated oviduct-specific expression of recombinant human tissue kallikrein[J].Poult Sci,2008,87(4):777-782.

[16] Cao D N,Wu H Y,Li Q Y,et al.Expression of recombinant human lysozyme in egg whites of transgenic hens[J].PLoS One,2015,10(2):e0118626.

[17] 朱秋菊,孫懷昌,王勁松,等.雞輸卵管暫態(tài)表達(dá)人溶菌酶的研究[J].生物技術(shù)通訊,2006,17(4):546-550.