王小蕾，段會娟，楊志遠(yuǎn)，劉立新，趙際成，潘 潔，劉月煥，林 健

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097)

馬流感是由正黏病毒科A型流感病毒屬病毒引起的馬、驢、騾等動物的一種急性呼吸道傳染病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定馬流感為法定報告動物疫病，我國將其列為三類動物疫病。馬流感在世界多個國家均有流行，該病的暴發(fā)給賽馬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。馬流感病毒(Subtype equine influenza virus，EIV)分為H7N7(馬A1型)和H3N8(馬A2型)2個亞型。H7N7 EIV于1956年在捷克布拉格馬群中分離到，但自1977年以后再未從馬體內(nèi)分離到；H3N8亞型EIV于1963年在美國邁阿密從阿根廷進(jìn)口的馬群中首次分離到，此后在多個國家暴發(fā)和流行[3]。H3N8亞型EIV根據(jù)分離地分成歐洲譜系和美洲譜系，目前這2種類型的EIV在養(yǎng)馬的國家都存在[4]。最近的遺傳進(jìn)化分析表明，美洲譜系H3N8亞型EIV進(jìn)一步分成3個分支，分別為南美分支、肯塔基分支和佛羅里達(dá)分支[5]，其中佛羅里達(dá)分支又分為Ⅰ群和Ⅱ群[3]。

新中國成立以來，我國大陸經(jīng)歷了4次較大的馬流感疫情。第1次流行發(fā)生在1974年，導(dǎo)致此次馬流感疫情的毒株是H7N7亞型的EIV，代表毒株為A/馬/京防/74-1。第2次疫情發(fā)生在1989年-1990年，導(dǎo)致疫情的是禽源的H3N8亞型EIV，代表毒株是A/euqine/Jilin/1/1989。第3次的馬流感疫情發(fā)生在1992年-1994年，也是由H3N8亞型EIV引起，代表毒株為A/equine/Qinghai/1/1994[6]。后來的回顧性調(diào)查研究表明，導(dǎo)致我國20世紀(jì)90年代流行的EIV為歐洲譜系[7]。2007年-2008年我國再次暴發(fā)馬流感大流行，由新疆蔓延至全國各地，沉重打擊了我國的養(yǎng)馬業(yè)和即將興起的賽馬業(yè)，分離到的流行株A/equine/Xinjiang/3/2007 (H3N8)[8]、A/Equine/Huabei/1/2007(H3N8)[9]通過遺傳進(jìn)化分析顯示為美洲譜系。最近一次報道的馬流感疫情于2013年8月發(fā)生在江蘇徐州，分離的毒株屬于美洲譜系[7]。

2016年4月北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物疫病研究室從北京密云發(fā)病馬群中分離到1株馬流感病毒，命名為A/equine/Beijing/2016，經(jīng)鑒定為H3N8亞型。對該病毒分離株及近10年來國內(nèi)部分H3N8亞型馬流感分離株進(jìn)行了HA基因進(jìn)化及抗原位點的初步分析，為我國馬流感防控選擇有效的疫苗候選株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雞胚 10日齡SPF雞胚，購于北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑和引物 TPB培養(yǎng)基、PBS(0.01 mol/L，pH 7.2)、雙抗、阿氏液和0.5%雞紅細(xì)胞懸液按常規(guī)制備。RNA提取試劑盒、RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。參考GenBank數(shù)據(jù)庫中H3N8亞型EIV的基因序列，用Primer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計HA基因和NA基因的特異性引物。引物序列見表1。

表1 HA和NA基因的特異性引物

1.1.3 EIV陰性、陽性參考血清及EIV H3亞型HI抗原 EIV H7N7 亞型(A/ equine/Prague/1/56)陽性血清購于英國 VLA ( Veterinary Laboratory Agency )；EIV H3亞型HI抗原(HB株)及陰性、陽性血清，購于中海生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 選擇臨床癥狀典型的病馬，用無菌棉拭子蘸取鼻腔分泌物，置于裝有TPB溶液的離心管；采集病馬的血液，分離血清。拭子及血清樣品置-20℃保存。

1.2.2 血清學(xué)檢測 分別采取3匹發(fā)病馬發(fā)病初期和發(fā)病后2周血清，用分離毒株、馬流感H3亞型HI抗原通過血凝抑制試驗檢測發(fā)病前后血清抗體。

1.2.3 病毒的分離和傳代 裝有分泌物拭子的離心管振蕩后5 000 r/min離心10 min，取上清用0.22 μm濾膜過濾。以0.2 mL/胚的劑量經(jīng)尿囊腔接種SPF雞胚，置36℃孵化至96 h，收獲24 h～96 h存活雞胚的尿囊液。將收獲的病毒尿囊液稀釋后，經(jīng)SPF雞胚傳至第3代，分別測定每代雞胚尿囊液對0.5%雞紅細(xì)胞懸液的凝集(HA)效價。

1.2.4 血凝試驗(HA) 將收集的F1～F3代雞胚尿囊液作為被檢抗原，與0.5%雞紅細(xì)胞進(jìn)行凝集試驗。

1.2.5 血凝抑制試驗(HI) 分別將F3代病毒液及EIV H3亞型HI抗原(HB株)用PBS稀釋成含6個血凝單位后作為被檢抗原，分別與H3N8、H7N7亞型EIV陽性參考血清及采集的發(fā)病馬血清進(jìn)行HI試驗。

1.2.6 HA基因和NA基因測序 病毒RNA提取和RT-PCR分別按試劑盒說明書進(jìn)行，HA和NA基因的擴增產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行載體構(gòu)建并測序。

1.2.6.1 序列分析 通過NCBI BLAST將病毒分離株與GenBank數(shù)據(jù)庫中的EIV進(jìn)行核苷酸序列同源性比較。將測得的HA基因核苷酸序列用DNA Star軟件推導(dǎo)出氨基酸序列，對該分離株和已報道的近年來部分國內(nèi)EIV分離株及目前OIE推薦疫苗株的HA氨基酸序列進(jìn)行比較分析。

1.2.6.2 繪制系統(tǒng)發(fā)育樹 應(yīng)用MEG6.0軟件，分別繪制HA基因的進(jìn)化樹，分析病毒分離株的遺傳演化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 臨床調(diào)查

發(fā)病馬場初期共有6匹賽馬發(fā)病，病初體溫稍微升高，一般在39℃左右，個別超過40℃，稽留3 d～5 d，結(jié)膜潮紅，流淚；病初干咳嚴(yán)重，后期轉(zhuǎn)為濕咳，有痰；病初流漿液性鼻液，后逐漸變成灰白色膿性分泌物，下頜淋巴結(jié)正常，觸診喉頭無疼痛反應(yīng)。病馬厭食，精神委頓，呼吸頻數(shù)。大多數(shù)馬病程持續(xù)1周左右，然后逐漸康復(fù)。之后周邊地區(qū)馬陸續(xù)出現(xiàn)類似癥狀，沒有死亡病例。

2.2 病毒分離

接種雞胚96 h內(nèi)全部存活，存活雞胚尿囊液對0.5%雞紅細(xì)胞的凝集效價為1∶16～1∶64之間。F1、F2代血凝效價較低，F(xiàn)3代血凝效價達(dá)到1∶64。

2.3 血凝抑制試驗

分離毒株與馬流感H7亞型陽性和陰性血清、發(fā)病初期的馬血清HI試驗結(jié)果均為陰性，與發(fā)病后2周的血清及馬流感H3亞型陽性血清為陽性反應(yīng)。此結(jié)果與馬流感H3亞型HI抗原(HB株)檢測結(jié)果一致，說明該病毒分離株為H3亞型。將該分離株命名為A/equine/Beijing/2016。具體檢測結(jié)果見表2。

2.4 HA、NA基因測序結(jié)果

用HA基因和NA基因的特異性引物進(jìn)行PCR，各得到一條特異性條帶(圖1)。

經(jīng)測序，A/equine/Beijing/2016的HA基因達(dá)1 768 bp，NCBI BLAST結(jié)果顯示，A/equine/Beijing/2016與A/equine/Xuzhou/01/2013 (H3N8) (GenBank:KF806985.1)同源性最高，達(dá)99%。NA基因為1 459 bp，與A/equine/Heilongjiang/SS1/2013 (H3N8)(GenBank:KC986392.2)同源性最高，達(dá)99%。A/equine/Beijing/2016為H3N8亞型。

表2 馬血清EIV HI效價

1.HA基因；2.NA基因；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 0001.HA gene; 2.NA gene; M.DNA Marker DL 2 000

2.5 HA基因的遺傳演化分析

如圖2所示，HA基因的遺傳進(jìn)化分析表明，A/equine/Beijing/2016 為H3N8亞型EIV美洲譜系的佛羅里達(dá)Ⅱ群，與國內(nèi)2007年以來的EIV分離株一致。

2.6 HA氨基酸序列分析

流感病毒的HA基因易發(fā)生變異，導(dǎo)致抗原性發(fā)生改變。將A/equine/Beijing/2016及國內(nèi)其他研究者報道的一部分美洲譜系佛羅里達(dá)Ⅱ群H3N8亞型EIV分離株推導(dǎo)的HA 氨基酸序列與OIE推薦的佛羅里達(dá)Ⅱ群疫苗候選株A/equine/Richmond/1/2007的HA 氨基酸序列進(jìn)行比較，發(fā)生改變的氨基酸位點如表3所示。根據(jù)H3亞型人流感病毒HA蛋白的抗原位點及序列特征[10]，人們推測了H3N8亞型馬流感病毒表面的許多重要的氨基酸位點，命名為A、B、C、D和E。由表3可見，相比于OIE推薦的疫苗候選株A/equine/Richmond/1/2007，分離株A/equine/Beijing/2016在抗原位點A(144 Ala→Thr)、抗原位點B(159Asn→Asp，198Glu→Gly)、抗原位點C(276Ile→Val)均發(fā)生了改變。

3 討論

近年來，國內(nèi)外不斷有馬流感發(fā)生的報道，所分離的毒株多為H3N8亞型美洲譜系的佛羅里達(dá)分支[11-15]。此次北京某馬場出現(xiàn)馬流感疑似疫情后，通過臨床調(diào)查和實驗室病毒分離、血清學(xué)檢測、分離毒株HA及NA基因序列測定和分析，證實此次分離毒株為H3N8亞型馬流感病毒，同樣屬于美洲譜系的佛羅里達(dá)Ⅱ群。2007年-2016年，北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物疫病研究室在內(nèi)蒙、甘肅、河北、新疆等地區(qū)進(jìn)行了馬流感疫情調(diào)查，并采集馬血清進(jìn)行抗體檢測。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，近年來馬流感在上述地區(qū)多次發(fā)生，其發(fā)生頻率遠(yuǎn)高于2007年之前，應(yīng)該引起行業(yè)的重視。

根據(jù)文獻(xiàn)報道[16]，5個公認(rèn)的抗原位點中如果有≥2個抗原位點同時出現(xiàn)≥4個氨基酸的變化，則意味著一個重要的抗原漂移。對此次EIV分離株的HA氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)，相比OIE推薦的佛羅里達(dá)Ⅱ群的疫苗候選株A/equine/Richmond/1/2007，該分離株出現(xiàn)了一個重要的抗原漂移，但其致病性、免疫原性等特性的研究有待進(jìn)行。2007年-2013年間的EIV分離株相互比對，也出現(xiàn)了一些位點的氨基酸序列變化，這提示HA的氨基酸序列可能處于不斷變異之中。目前國內(nèi)馬流感尚無商品化疫苗可用于免疫預(yù)防，但對馬流感疫苗的研發(fā)已有多項報道[17]。流感病毒HA基因的抗原漂移可能會降低疫苗的保護(hù)效力，致使在疫苗免疫的馬匹中發(fā)生馬流感，因此在疫苗研發(fā)時根據(jù)流行情況選擇新分離病毒株作為疫苗候選株顯得尤為重要。而這也為當(dāng)前馬流感的防疫工作帶來挑戰(zhàn)，有必要加強對國內(nèi)馬流感病毒的流行病學(xué)監(jiān)測。

■為本此分離得到的分離株；▲為我國大陸2007年以來的部分EIV分離株；◆為我國大陸20世紀(jì)90年代部分EIV分離株■ The isolate of this test; ▲Part of EIV isolates in mainland China since 2007; ◆Part of EIV isolates in mainland China in 1990’s

馬流感病毒株Equineinfluenzavirus氨基酸位置Aminoacidposition71147135A142144155B156158159165168198B228234240276C290291329Richmond/1/2007NASRGATKGNNMEGWGINERHuabei/1/2007··················D·Xinjiang/3/2007··TI·······T······D·Xinjiang/5/2007··TI··············D·Guangxi/1/2008····E··A···········D·Hubei/6/2008··TI··············D·Gansu/7/2008··················D·InnerMongolia/8/2008··TI··············D·Liaoning/9/2008··T·······D·······DKHeilongjiang/10/2008············G·····D·Heilongjiang/1/2010·······NE···G·····D·Heilongjiang/1/2011·····T······G·····D·Heilongjiang/SS1/2013·····T······GR····D·Xuzhou/01/2013·····T······G·C·V·D·Beijing/2016·S···T···D··G···VTD·

參考文獻(xiàn):

[1] Guthrie A J,Stevens K B,Bosman P P.The circumstances surrounding the outbreak and spread of equine influenza in South Africa [J].Rev Sci Tech,1999,18(1):179-185.

[2] Powell D G,Watkins K L,Li P H,et al.Outbreak of equine influenza among horses in Hong Kong during 1992 [J].Vet Rec,1995,136(21):531-536.

[3] Bryant N A,Rash A S,Russell C A,et al.Antigenic and genetic variations in European and North American equine influenza virus strains (H3N8) isolated from 2006 to 2007 [J].Vet Microbiol,2009,138(1-2):41-52.

[4] Daly J M,Lai A C,Binns M M,et al.Antigenic and genetic evolution of equine H3N8 influenza a viruses [J].J Gen Virol,1996,77 ( Pt 4):661-671.

[5] Lai A C,Chambers T M,Holland Re Jr,et al.Diverged evolution of recent equine-2 influenza (H3N8) viruses in the Western Hemisphere [J].Arch Virol,2001,146(6):1063-1074.

[6] 楊建德,相文華.我國馬流感的研究現(xiàn)狀 [J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2002(3):42-44.

[7] 葛菲菲,劉 健,鞠厚斌,等.1株H3N8亞型馬流感病毒的分離鑒定及全基因進(jìn)化分析 [J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2015,35(9):1435-1440.

[8] 戴伶俐.馬流感病毒A/Equine/Xinjiang/3/07(H3N8)HA基因的序列分析及兩種PCR檢測方法的建立[D].黑龍江哈爾濱：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2009.

[9] 蔣桃珍,劉月煥,林 健,等.2007年華北地區(qū)H3N8亞型馬流感病毒的分離與鑒定 [J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2010,30(5):607-611.

[10] Wiley D C,Wilson I A,Skehel J J.Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation [J].Nature,1981,289(5796):373-378.

[11] Alves Beuttemmuller E,Woodward A,Rash A,et al.Characterisation of the epidemic strain of H3N8 equine influenza virus responsible for outbreaks in South America in 2012 [J].Virol J,2016，13:45. doi: 10.1186/s12985-016-0503-9.

[12] Rash A,Morton R,Woodward A,et al.Evolution and divergence of H3N8 equine influenza viruses circulating in the United Kingdom from 2013 to 2015 [J].Pathogens,2017,6(1):1-16.

[13] Fougerolle S,Legrand L,Lecouturier F,et al.Genetic evolution of equine influenza virus strains (H3N8) isolated in France from 1967 to 2015 and the implications of several potential pathogenic factors [J].Virology,2017,505:210-217.

[14] 趙 釗,郭 巍,關(guān)平原,等.黑龍江省一株馬流感病毒的全基因組測序及同源性分析 [J].中國動物檢疫,2015,32(12):69-72.

[15] 馮淑萍,韋建華,易春華,等.廣西馬流感H3N8毒株的HA基因序列測定與分析 [J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2015(13):31-34.

[16] Wilson I A,Cox N J.Structural basis of immune recognition of influenza virus hemagglutinin [J].Annu Rev Immunol,1990,8:737-771.

[17] 劉春國,王 偉,劉 飛,等.H3N8亞型馬流感病毒VLPs的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析 [J].中國獸醫(yī)科學(xué),2014,44(3):240-244.