何賢發(fā),馮方東，徐一凡，高 博，施文文，薛夢(mèng)琦，郭偉娜

(安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽 233100)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)是一種條件致病菌，能夠引起多種動(dòng)物疾病，包括禽霍亂、豬肺疫和萎縮性鼻炎、牛和家兔出血性敗血癥等，對(duì)全世界畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。特別是在外界應(yīng)激條件下，比如氣候突變、長途運(yùn)輸、寄生蟲感染、營養(yǎng)不良等均可能導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，從而發(fā)生多殺性巴氏桿菌的內(nèi)源性或外源性感染[2]。根據(jù)莢膜抗原的不同，多殺性巴氏桿菌主要分為5個(gè)血清型(A、B、D、E、F)[3]，其中A血清型主要感染禽類，而B血清型和E血清型與出血性敗血癥有關(guān)，D血清型主要引起豬傳染性萎縮性鼻炎。莢膜不僅是血清型分型的依據(jù)，還是多殺性巴氏桿菌一種重要的毒力因子，其他毒力因子還包括脂多糖、皮膚壞死毒素及外膜蛋白等。

研究發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌的莢膜和外膜蛋白還具有一定的免疫原性，如外膜蛋白H不僅能與宿主細(xì)胞受體相互作用，在感染的起始階段介導(dǎo)細(xì)菌黏附到宿主細(xì)胞，而且還是宿主免疫系統(tǒng)重要的靶位點(diǎn)[4]。因此，這些毒力基因的檢測(cè)對(duì)研究多殺性巴氏桿菌致病機(jī)制及疫苗研發(fā)均具有重要意義。目前，對(duì)禽源多殺性巴氏桿菌毒力基因方面的研究較少，并且已有的常規(guī)PCR方法每次只能檢測(cè)單個(gè)基因，繁瑣費(fèi)時(shí)。多重PCR方法不僅具有普通PCR的高特異性和敏感性等優(yōu)點(diǎn)，還能同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因片段，快速準(zhǔn)確，已用于多種病原的鑒定[5-6]或同種病原多個(gè)基因的檢測(cè)[7-8]。因此，本研究主要是建立一種針對(duì)禽源多殺性巴氏桿菌毒力基因的多重PCR方法，為其毒力基因的快速檢測(cè)及致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步篩選保護(hù)性抗原及疫苗研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雞源多殺性巴氏桿菌分離株HN-1和CZ-6、番鴨源多殺性巴氏桿菌分離株MD-1(A血清型)、仔豬黃痢大腸埃希菌、雞白痢沙門菌分離株，均由安徽科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存；PCR擴(kuò)增試劑盒、瓊脂糖、50×TAE緩沖液、DNA Marker DL 1 500等，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)[9]中的多殺性巴氏桿菌9個(gè)毒力基因引物序列，由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成引物。

1.2.2 毒力基因的PCR擴(kuò)增及敏感性測(cè)定 以番鴨源多殺性巴氏桿菌分離株MD-1株為目的菌，煮沸法提取核酸，并用NanoDrop One超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度，然后用滅菌水進(jìn)行10倍系列稀釋，分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4等濃度，測(cè)定單個(gè)毒力基因PCR擴(kuò)增的敏感性。反應(yīng)體系25 μL：模板2 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，滅菌水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.2.3 毒力基因多重PCR擴(kuò)增及優(yōu)化 將9個(gè)毒力基因分5組分別對(duì)多殺性巴氏桿菌分離株MD-1進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，多重PCR體系1為檢測(cè)pfhA、oma87和ompH基因，多重PCR體系2為檢測(cè)hgbB、hgbA和exBD-tonB基因，多重PCR體系3為檢測(cè)sodC、sodA和nanB基因，多重PCR體系4為檢測(cè)pfhA和nanB基因，多重PCR體系5為檢測(cè)sodC、sodA、oma87和ompH基因。

反應(yīng)體系先按照1.2.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果適當(dāng)調(diào)整引物濃度，擴(kuò)增較強(qiáng)的基因降低引物用量至0.25 μL、0.5 μL，擴(kuò)增較弱的基因增加引物用量至1.25 μL、1.5 μL。反應(yīng)條件同1.2.2。

1.2.4 毒力基因多重PCR方法特異性的測(cè)定 采用優(yōu)化后的多重PCR方法分別對(duì)雞源多殺性巴氏桿菌分離株HN-1和CZ-6，以及仔豬黃痢大腸埃希菌、雞白痢沙門菌分離株進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，同時(shí)以滅菌水作為陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 毒力基因多重PCR方法敏感性的測(cè)定 多殺性巴氏桿菌分離株MD-1的核酸分別進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4系列倍比稀釋后，各取2 μL作為模板，采用多重PCR方法進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，以滅菌水作為陰性對(duì)照。

1.2.6 毒力基因多重PCR方法重復(fù)性的測(cè)定 采用多重PCR方法對(duì)不同稀釋度的多殺性巴氏桿菌分離株MD-1的核酸分別在不同時(shí)間進(jìn)行3次重復(fù)性檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 毒力基因的PCR擴(kuò)增及敏感性測(cè)定結(jié)果

多殺性巴氏桿菌MD-1分離株的核酸用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定，濃度為1.81×108copies/μL。該菌株毒力基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，9個(gè)毒力基因均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的條帶(圖1)，PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析，均與禽源多殺性巴氏桿菌相應(yīng)毒力基因序列相符。

將多殺性巴氏桿菌MD-1分離株的核酸分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4等濃度，然后測(cè)定9個(gè)毒力基因PCR擴(kuò)增的敏感性，結(jié)果見圖2。當(dāng)模板稀釋為10-1、10-2時(shí)，均可見目的條帶，但稀釋至10-3時(shí)，即為1.81×105copies/μL，pfhA和sodC目的基因條帶不明顯；在稀釋為10-4濃度，即1.81×104copies/μL時(shí)，pfhA和sodC目的基因沒有條帶，exBD-tonB目的基因有較弱條帶，而其他6個(gè)毒力目的基因條帶明顯。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 500；1～9.分別為pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的PCR產(chǎn)物；10～18.分別為pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 500；1-9.PCR products of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH,respectively; 10-18.Negative controls of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH,respectively

圖1毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR amplification results of virulence genes

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 500；1～9,10～18,19～27,28～36.分別為模板為10-1,10-2,10-3,10-4稀釋時(shí)，pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的PCR產(chǎn)物；37～45.分別為pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的陰性對(duì)照

M.DNA Marker 1 500; 1-9,10-18,19-27,28-36.PCR products of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH amplified for templates diluted as 10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 37-45.Negative controls of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH,respectively

圖2毒力基因PCR擴(kuò)增的敏感性測(cè)定結(jié)果

Fig.2 Sensitivity test results of PCR amplification for virulence genes

2.2 多重PCR擴(kuò)增及優(yōu)化結(jié)果

多重PCR擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)體系中的上、下游引物用量經(jīng)調(diào)整優(yōu)化后分別為：pfhA基因1.5 μL，sodC和hgbB基因?yàn)?.5 μL，exBD-tonB基因?yàn)?.25 μL，其余5個(gè)基因均為1 μL，可有效擴(kuò)增出所有目的條帶。

9個(gè)毒力基因5種多重PCR體系的擴(kuò)增結(jié)果見圖3。由圖3可知，多重PCR體系1、3、4、5擴(kuò)增效果較好，如pfhA、oma87和ompH基因，sodC、sodA和nanB基因組成的3重PCR，pfhA和nanB基因組成的雙重PCR，sodC、sodA、oma87和ompH基因組成的4重PCR，均能檢測(cè)出多種毒力基因，但多重PCR體系2中有非特異性條帶，因此選用多重PCR體系1、3、4、5進(jìn)行特異性和敏感性檢測(cè)。

2.3 多重PCR方法特異性測(cè)定結(jié)果

多重PCR體系1、3、4、5對(duì)多殺性巴氏桿菌分離株HN-1、CZ-6，以及仔豬黃痢大腸埃希菌、雞白痢沙門菌分離株的PCR擴(kuò)增結(jié)果分別見圖4。由圖4可知，2株禽源多殺性巴氏桿菌均擴(kuò)增出相應(yīng)的毒力基因，目的條帶大小相符；大腸埃希菌和沙門菌分離株沒有擴(kuò)增出條帶，表明本研究所建立的4種多重PCR體系特異性較強(qiáng)。

2.4 多重PCR方法敏感性測(cè)定結(jié)果

多殺性巴氏桿菌分離株MD-1毒力基因多重PCR體系1、3、4、5的敏感性測(cè)定結(jié)果見圖5。由圖5可知，多重PCR體系1、3、4的檢測(cè)敏感性為10-2，即1.81×106copies/μL的核酸，多重PCR體系5甚至可檢測(cè)至10-3，即1.81×105copies/μL的核酸。毒力基因4種多重PCR體系與單個(gè)毒力基因PCR檢測(cè)的敏感性均一致。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 500；1～3.分別為pfhA、oma87和ompH基因的PCR產(chǎn)物；6～8.分別為hgbB、hgbA、exBD-tonB基因的PCR產(chǎn)物；11～13.分別為sodC、sodA和nanB基因的PCR產(chǎn)物；16～17.分別為pfhA和nanB基因的PCR產(chǎn)物；20～23.分別為sodC、sodA、oma87和ompH基因的PCR產(chǎn)物；4、9、14、18、24.分別為多重PCR體系1、2、3、4、5的PCR產(chǎn)物；5、10、15、19、25.分別為多重PCR體系1、2、3、4、5的陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 500；1-3.PCR products of pfhA,oma87 and ompH genes,respectively; 6-8.PCR products of hgbB,hgbA and exBD-tonB genes,respectively; 11-13.PCR products of sodC,sodA and nanB genes,respectively; 16-17.PCR products of pfhA and nanB genes,respectively; 20-23.PCR products of sodC,sodA,oma87 and ompH genes,respectively; 4,9,14,18,24.Products of multiplex PCR 1,2,3,4 and 5,respecitively; 5,10,15,19,25.Negative control of multiplex PCR 1,2,3,4 and 5,respecitively

圖3毒力基因的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.3 Multiplex PCR amplification results of virulence genes

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 500；1、6、11、16.分別為菌株HN-1多重PCR體系1、3、4、5的PCR產(chǎn)物；2、7、12、17.分別為菌株CZ-6多重PCR體系1、3、4、5的PCR產(chǎn)物；3、8、13、18.分別為仔豬黃痢大腸埃希菌多重PCR體系1、3、4、5的PCR產(chǎn)物；4、9、14、19.分別為雞白痢沙門菌多重PCR體系1、3、4、5的PCR產(chǎn)物；5、10、15、20.分別為多重PCR體系1、3、4、5的陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 500; 1,6,11,16.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 of strain HN-1,respectively; 2,7,12,17.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 of strain CZ-6,respectively; 3,8,13,18.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 forE.colifrom piglets with yellow scour,respectively; 4,9,14,19.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 forSalmonellapullorum,respectively; 5,10,15,20.Negative control of multiplex PCR 1,3,4 and 5,respectively

圖4多重PCR方法的特異性檢測(cè)結(jié)果

Fig.4 Specificity test results of multiplex PCR assay

2.5 多重PCR方法重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

采用多重PCR體系1、3、4、5分別對(duì)不同稀釋度的模板在不同時(shí)間進(jìn)行了3次PCR擴(kuò)增，結(jié)果均一致(圖略)，表明建立的多重PCR方法重復(fù)性較好。

3 討論

近年來，多殺性巴氏桿菌毒力因子方面的研究較多，主要包括黏附素和定殖因子、鐵離子調(diào)節(jié)和攝取蛋白、唾液酸酶、透明質(zhì)酸酶、超氧化物歧化酶、毒素、脂多糖、莢膜及多種外膜蛋白等。Tang Xi-biao等[10]和Furian T Q等[11]對(duì)豬源和禽源多殺性巴氏桿菌中毒力基因的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外膜蛋白、黏附素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、唾液酸酶和超氧化物歧化酶等16個(gè)毒力相關(guān)基因的檢出率均高于90%；Varga Z等[12]對(duì)42株鵝源多殺性巴氏桿菌毒力基因的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鐵攝取蛋白相關(guān)基因(hgbA，hgbB)存在于所有菌株，而唾液酸酶基因(nanH、nanB)僅在部分菌株檢出；Furian T Q等[13]對(duì)禽霍亂病例中分離的25株多殺性巴氏桿菌毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ompH、oma87、sodC、hgbA、hgbB和nanB等基因的檢出率均為100%，pfhA和sodA基因的檢出率分別為60%和96%；Khamesipour F等[14]對(duì)30株牛源多殺性巴氏桿菌的毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，23個(gè)毒力基因在肺炎肺臟中的分離株中均被檢出，但健康肺臟中的分離株只檢出16個(gè)毒力基因。研究發(fā)現(xiàn)[15]，多殺性巴氏桿菌中毒力基因的分布與牛感染后的臨床表現(xiàn)有較強(qiáng)地正相關(guān)性。由此可知，不同宿主和血清型的多殺性巴氏桿菌中毒力基因的存在情況均會(huì)影響其致病性，因此，毒力基因的檢測(cè)對(duì)多殺性巴氏桿菌致病機(jī)制的研究極其重要。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 500；1～5.模板分別稀釋為100、10-1、10-2、10-3和10-4時(shí)，多重PCR體系1的PCR產(chǎn)物；7～11.模板分別稀釋為100、10-1、10-2、10-3和10-4時(shí)，多重PCR體系3的PCR產(chǎn)物；13～17.模板分別稀釋為100、10-1、10-2、10-3和10-4時(shí)，多重PCR體系4的PCR產(chǎn)物；19～23.模板分別稀釋為100、10-1、10-2、10-3和10-4時(shí)，多重PCR體系5的PCR產(chǎn)物；6、12、18、24.分別為多重PCR體系1、3、4、5的陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 500; 1-5.PCR products of multiplex PCR 1 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 7-11.PCR products of multiplex PCR 3 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 13-17.PCR products of multiplex PCR 4 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 19-23.PCR products of multiplex PCR 5 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 6,12,18,24.Negative controls of multiplex PCR 1,3,4 and 5,respectively

圖5多重PCR方法的敏感性測(cè)定結(jié)果

Fig.5 Sensitivity test results of multiplex PCR assay

多重PCR方法的優(yōu)勢(shì)是能夠快速、準(zhǔn)確地同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，提高檢測(cè)效率，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，成本低廉，有較強(qiáng)的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。目前，已有多種多重PCR方法用于多種病原[5-6]或多個(gè)基因[7-8]的檢測(cè)，但用于多殺性巴氏桿菌毒力基因方面的研究較少，除用于莢膜分型外[16]，對(duì)其他毒力基因檢測(cè)方面的報(bào)道更少。Furian T Q等[13]建立了3種多重PCR體系用于多殺性巴氏桿菌毒力基因的檢測(cè)，但均不能檢測(cè)ompH基因，而本研究建立的多重PCR體系1和5均可檢測(cè)該基因。本研究主要是對(duì)禽源多殺性巴氏桿菌分離株的9個(gè)毒力基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，最終篩選出4種多重PCR體系用于其中6個(gè)毒力基因的檢測(cè)(pfhA、nanB、ompH、oma87、sodA和sodC)，根據(jù)多重PCR體系1、3或多重PCR體系4、5均可檢測(cè)出這6個(gè)基因，并且這些多重PCR方法特異性強(qiáng)，敏感性較高，4種多重PCR體系均可檢測(cè)至1.81×106copies/μL的核酸，具有可重復(fù)性。本研究建立的多重PCR方法有利于禽源多殺性巴氏桿菌中毒力基因的快速檢測(cè)，從而為其致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，也為其保護(hù)性抗原的篩選和疫苗研制提供參考。

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