馮 茹，高宇瑾，張夢(mèng)荷，高 輝，張 豪，呂 濤，陳 成，楊彥濤，王承寶*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.陜西省楊凌區(qū)職業(yè)技術(shù)教育中心，陜西楊凌 712100)

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAV)屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬，根據(jù)群特異性抗原的不同，可將其分為3群，即Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群[1]。其中，Ⅰ群禽腺病毒包括從雞、火雞、鵝及其他禽類分離的共12個(gè)血清型，能夠與其他引起禽類呼吸道疾病的病原微生物共同作用于家禽，該病呈隱性感染，既可經(jīng)排泄物水平傳播，也可經(jīng)卵垂直傳播，污染雞胚，代表株為雞胚致死性孤兒病毒(Chicken embnyo lethal orphan,CELO)[2]。McFerran J B等[3]利用L1～L4這4個(gè)高變環(huán)的特點(diǎn)和RFLP技術(shù)把Ⅰ群禽腺病毒劃分為A～E 5個(gè)基因型。

Ⅰ群禽腺病毒為線狀雙鏈DNA病毒[4]，五鄰體(Penton)、六鄰體(Hexon)和纖維蛋白(Fiber)是病毒的3個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白，它們共同構(gòu)成病毒核衣殼。其中，纖維蛋白主要通過(guò)識(shí)別宿主細(xì)胞上的特異受體而使病毒吸附結(jié)合在宿主細(xì)胞上，基因組中Fiber-1和Fiber-2基因表達(dá)的2個(gè)纖突蛋白與該病毒的毒力和免疫原性相關(guān)[5]。缺失Fiber-1基因后病毒依然能復(fù)制，但失去野生型病毒特有的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。Fiber-2基因?qū)Σ《驹鲋场⒔M裝及擴(kuò)散的某個(gè)階段是必須的，缺失該基因不能產(chǎn)生病毒粒子[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)編碼纖突蛋白的基因區(qū)與禽腺病毒的毒力和抗原性有關(guān)[8]。33K蛋白是FAV-Ⅰ的非結(jié)構(gòu)蛋白，參與衣殼的形成過(guò)程[9]，為空殼病毒粒子的組成成分，當(dāng)病毒DNA進(jìn)入衣殼時(shí)，33K蛋白開始被蛋白酶水解[10-11]。此外，pⅢa蛋白是病毒傳染相關(guān)的剪接增強(qiáng)子，33K蛋白通過(guò)pⅢa充分激活腺病毒的剪切，啟動(dòng)蛋白質(zhì)裝配。pⅢa蛋白位于病毒衣殼的表面，由前體蛋白剪切后磷酸化而成，每個(gè)五鄰體基底與5個(gè)pⅢa單體相連[12-13]。因此，本試驗(yàn)擬克隆陜西分離株的33K、Fiber-1、Fiber-2和pⅢa基因，并對(duì)序列進(jìn)行分析，為研究其蛋白結(jié)構(gòu)及在Ⅰ群禽腺病毒的診斷以及預(yù)防過(guò)程中發(fā)揮的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源與雞胚 2017年從陜西省某疑似腺病毒感染的肉雞場(chǎng)采集病料；SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通有限公司。

1.1.2 受菌體與載體 大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,北京博邁德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；含有Hind Ⅲ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)的pCold-SUMO載體，購(gòu)自淼靈質(zhì)粒平臺(tái)。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ，NEB生物公司產(chǎn)品；DNA連接酶、基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒、DNA Marker DL 5 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master mix，天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離純化及基因組DNA的提取 參照文獻(xiàn)[14-15]介紹的方法，取發(fā)病雞的肝臟組織處理后通過(guò)卵黃囊接種于10日齡SPF雞胚，于37℃溫箱孵育24 h后觀察，剔除死胚，每天照蛋2次，溫育至96 h以上，將無(wú)致死胚全部置于4℃，4 h后收獲尿囊液?；蚪M的提取參照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作，于-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中公布的Ⅰ群禽腺病毒的基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5設(shè)計(jì)了如下所示的特異性引物，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司楊凌實(shí)驗(yàn)室合成如下。

33K上游引物序列為TTCAAGCTTATGGCCCAGAGAATGGTC；下游引物序列為CTATCTAGACTAGCGTTGCGAGCCCTC；Fiber-1上游引物序列為TTCAAGCTTATGTCGGCCCTAATCGCC；下游引物序列為CTATCTAGATTAGGGGCCCGGAGCATT；Fiber-2上游引物序列為TTCAAGCTTATGCTCCGGGCCCCTAAA；下游引物序列為CTATCTAGATTACGGGAGGGAGGCCGC；pⅢa上游引物序列為TTCAAGCTTATGAGTTCGACTGAAGTC；下游引物序列為CTATCTAGATTAGTAAAAGCGTAGGCG。 下劃線處是酶切位點(diǎn)，前者為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，后者是XbaⅠ酶切位點(diǎn)，方便其擴(kuò)增片段之后插入到pCold-SUMO質(zhì)粒的Hind Ⅲ和XbaⅠ克隆位點(diǎn)，為后續(xù)進(jìn)行蛋白的原核表達(dá)奠定一定的基礎(chǔ)。

PCR擴(kuò)增體系為50 μL，其中2×PCR Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 2 μL，加ddH2O補(bǔ)充至50 μL。反應(yīng)按下列條件進(jìn)行：94℃ 2 min； 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 2 min，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 目的片段的克隆與鑒定 FAV-Ⅰ基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，按膠回

收試劑盒使用說(shuō)明回收純化目的條帶，用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ對(duì)PCR產(chǎn)物和pCold-SUMO載體雙酶切后回收酶切產(chǎn)物，用連接酶于16℃連接30 min，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，加入LB液體培養(yǎng)基于37℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h后，涂布到含氨芐抗生素(Amp)的LB瓊脂平板37℃過(guò)夜培養(yǎng)，篩選白色菌落進(jìn)行挑菌，接種于3 mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，用質(zhì)粒提取試劑盒提純重組質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒序列測(cè)定及分析 將所獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析。從GenBank中下載Ⅰ群禽腺病毒相關(guān)毒株的基因序列：FAV-2：685(KT862805.1)；FAV-3：SR49(KT862807.1)；FAV-4：CH/HNJZ/2015(KU558760.1)，CH/SDDZ/2015(KU558761.1)，CH/SXCZ/2015(KU558762.1)，CH/AHBZ/2015(KU569295.1)，CH/JSXZ/2015(KU569296.1)，HLJFAd15(KU991797.1)，HLJDAd(KX538980.1)，B1-7(KU342001.1)；FAV-5：340(NC-021221.1)；FAV-8a：TR59(KT862810.1)；FAV-8b：764(KT862811.1)；FAV-9：A-2A(AF083975.2)；FAV-11：380(KT862812.1)，HEV(AF074946.1)，EDSV(Y09598.1)，應(yīng)用DNA Star和MEGA7.0軟件以Clustal W方法進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 FAV-Ⅰ33K、Fiber-1、Fiber-2、pⅢa蛋白基因的PCR擴(kuò)增

以陜西分離株基因組DNA為模版，PCR擴(kuò)增基因序列，經(jīng)濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果如圖1所示，可見33K、Fiber-1、Fiber-2、pⅢa分別約為590、1 300、1 400、1 800 bp的條帶，與預(yù)期的片段大小相符。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將回收的蛋白基因片段、pCold-SUMO載體雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)Hind Ⅲ、XbaⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，經(jīng)濃度為10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖2所示，從重組質(zhì)粒中切出空載體pCold-SUMO 4 700 bp和目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，說(shuō)明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1. 33K；2.Fiber-1；3.Fiber-2；4. pⅢa；5.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 5 000; 1. 33K; 2.Fiber-1; 3.Fiber-2; 4. pⅢa; 5.Negative control

圖1 FAV-Ⅰ33K、Fiber-1、Fiber-2和pⅢa基因的PCR結(jié)果

Fig.1 PCR amplification result of FAV-Ⅰ 33K，F(xiàn)iber-1，F(xiàn)iber-2 and pⅢa genes

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.pCold-SUMO-33K雙酶切; 2.pCold-SUMO-Fiber-1雙酶切; 3.pCold-SUMO-Fiber-2雙酶切; 4.pCold-SUMO-pⅢa雙酶切

M.DNA Marker DL 5 000; 1.pCold-SUMO-33K digested withHind Ⅲ andXbaⅠ; 2.pCold-SUMO-Fiber-1 digested withHind Ⅲ andXbaⅠ; 3.pCold-SUMO-Fiber-2 digested withHind Ⅲ andXbaⅠ; 4.pCold-SUMO-pⅢa digested withHind Ⅲ andXbaⅠ

圖2重組質(zhì)粒的酶切鑒定

Fig.2 Identification of recombinant plasmid digested withHind Ⅲ andXbaⅠ

2.3 基因序列分析

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列分析表明獲得了含上述蛋白基因的克隆，將序列提交至GenBank，登錄號(hào)分別為33K(MF595802)、Fiber-1(MF595801)、Fiber-2(MF595799)、pⅢa(MF595800)。用DNA Star和BLAST軟件將測(cè)得的基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中收錄的國(guó)內(nèi)外FAV-4核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，分析可得所克隆的33K基因長(zhǎng)585 bp，共編碼194個(gè)氨基酸，與國(guó)內(nèi)外FAV-4對(duì)照毒株的同源性相比，其核苷酸同源性為99.3%～100%，氨基酸同源性為91.5%～100%；Fiber-1基因長(zhǎng)1 296 bp，共編碼431個(gè)氨基酸，其核苷酸同源性為98.5%～100%，氨基酸同源性為65.9%～100%；Fiber-2基因長(zhǎng)1 440 bp，共編碼479個(gè)氨基酸，其核苷酸同源性為98.1%～100%，氨基酸同源性為99.3%～100%；pⅢa基因長(zhǎng)1 773 bp，共編碼590個(gè)氨基酸，其核苷酸同源性為98.6%～100%，氨基酸同源性為98.5%～100%，具體見表1～表4。用MEGA7.0繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，遺傳進(jìn)化分析顯示(圖3～圖6)，陜西分離株與Ⅰ群禽腺病毒親緣關(guān)系較近，特別是與血清4型的禽腺病毒更接近，與血清2型、3型、5型、8型、9型和11型相對(duì)較遠(yuǎn)，結(jié)果顯示，陜西分離株確為Ⅰ群禽腺病毒血清4型。

圖3 33K序列的進(jìn)化分析

圖4 Fiber-1序列的進(jìn)化分析

3 討論

禽心包積液-包涵體肝炎綜合征(Hydropericardium syndrome-inclusion body hepatitis，HPS-IBH)是主要由禽腺病毒4型(Fowl adenovirus-4，F(xiàn)AV-4)引起的一種高傳染性和高死亡率的新型家禽疾病。2015年6月以來(lái)，我國(guó)多數(shù)省份的雞群發(fā)生該病，主要流行C和E兩種基因型，4和8b兩種血清型。該病的發(fā)病特征為3周齡～5周齡雞突然死亡，病死率高達(dá)80%[16-18]。沒有明顯的臨床癥狀，個(gè)別雞在死亡前出現(xiàn)精神沉郁、羽毛卷曲等臨床表現(xiàn)。病死雞的剖檢病變主要為心包腔中蓄積有大量的淡黃色水樣或膠狀液體，心臟松弛，肝臟充血、腫大。近年來(lái)，隨著家禽養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，由FAV-4引起的心包積液-包涵體肝炎綜合征等，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[19-20]。

圖5 Fiber-2序列的進(jìn)化分析

圖6 pⅢa序列的進(jìn)化分析

毒株Strains123456789101112131415161***10010010010010010010099.352.751.151.149.148.248.147.22100***10010010010010010099.352.751.151.149.148.248.147.23100100***10010010010010099.352.751.151.149.148.248.147.24100100100***10010010010099.352.751.151.149.148.248.147.25100100100100***10010010099.352.751.151.149.148.248.147.26100100100100100***10010099.352.751.151.149.148.248.147.27100100100100100100***10099.352.751.151.149.148.248.147.28100100100100100100100***99.352.751.151.149.148.248.147.2991.591.591.591.591.591.591.591.5***52.350.650.749.147.64846.51025.625.625.625.625.625.625.625.626.1***62.963.567.375.257.475.41123.723.723.723.723.723.723.723.722.320.3***9968.967.166.7671223.623.623.623.623.623.623.623.622.220.298.9***6967.366.467.31324.724.724.724.724.724.724.724.725.833.628.828.7***82.966.282.71420.920.920.920.920.920.920.920.921.996.718.218.134.1***64.6991520.620.620.620.620.620.620.620.619.6352323.420.930.3***64.81621.221.221.221.221.221.221.221.220.995.816.116.130.772.129.4***

注：右上為核苷酸同源性，左下為氨基酸同源性;1.SX17;2.CH/HNJZ/2015;3.CH/SDDZ/2015;4.CH/SXCZ/2015;5.CH/AHBZ/2015;6.CH/JSXZ/2015;7.HLJFAd15;8.HLJDAd15;9.B1-7;10.380;11.764;12.TR59;13.SR49;14.685;15.340;16.A-2A。

Note：The nucleic acids were showed in the right upper,amino acids in the left lower;1.SX17;2.CH/HNJZ/2015;3.CH/SDDZ/2015;4.CH/SXCZ/2015;5.CH/AHBZ/2015;6.CH/JSXZ/2015;7.HLJFAd15;8.HLJDAd15;9.B1-7;10.380;11.764;12.TR59;13.SR49;14.685;15.340;16.A-2A.

盡管FAV感染在國(guó)內(nèi)雞場(chǎng)十分普遍，但我國(guó)對(duì)該病的研究還相對(duì)薄弱。本研究通過(guò)基因克隆技術(shù)，構(gòu)建了4個(gè)重組質(zhì)粒，成功克隆33K、Fiber-1、Fiber-2和pⅢa基因，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，序列分析發(fā)現(xiàn)所克隆序列與Ⅰ群腺病毒中血清4型同源性最高，為98%～100%，與其他血清型同源性較低，33K、Fiber-1、Fiber-2、pⅢa基因與其他血清型同源性分別為47.2%～52.7%、29.8%～44.3%、32.4%～52.7%、33.9%～70.8%。從基因遺傳進(jìn)化樹上看，4個(gè)基因均與Ⅰ群禽腺病毒親緣關(guān)系最近，特別與血清4型最接近，而與Ⅱ群、Ⅲ群FAV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于不同的進(jìn)化支。綜上分析表明，陜西分離株歸屬于Ⅰ群禽腺病毒血清4型，對(duì)進(jìn)一步研究該病在陜西的流行和防治等具有重要意義。依據(jù)基因的特異性及其在宿主免疫反應(yīng)中的作用，本研究在獲得相關(guān)目的基因的同時(shí)，將相關(guān)基因克隆入pCold-SUMO原核表達(dá)載體用于后期的蛋白表達(dá)和純化，選用的pCold-SUMO表達(dá)載體帶有SUMO標(biāo)簽，可實(shí)現(xiàn)蛋白在E.coli中的高效可溶性表達(dá)，后期的研究成果也為FAV-4病毒感染的診斷和蛋白功能分析等奠定了基礎(chǔ)。

表2 Fiber-1基因核苷酸與推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比較結(jié)果

注：右上為核苷酸同源性，左下為氨基酸同源性;1.SX17;2.CH/HNJZ/2015;3.CH/SXCZ/2015;4.CH/JSXZ/2015;5.CH/SDDZ/2015;6.CH/AHBZ/2015;7.HLJFAd15;8.HLJDAd15;9.B1-7;10.764;11.TR59;12.A-2A;13.SR49;14.380;15.340;16.685;17.HEV;18.EDSV。

Note：The nucleic acids were showed in the right upper,amino acids in the left lower;1.SX17;2．CH/HNJZ/2015;3．CH/SDDZ/2015;4．CH/SXCZ/2015;5．CH/AHBZ/2015;6．CH/JSXZ/2015;7．HLJFAd15;8．HLJDAd15;9．B1-7;10．764;11．TR59;12．380;13．A-2A;14．SR49;15．340;16．685;17．HEV;18．EDSV.

表3 Fiber-2基因核苷酸與推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比較結(jié)果

注：右上為核苷酸同源性，左下為氨基酸同源性；1.SX17;2.CH/HNJZ/2015;3.CH/SDDZ/2015;4.CH/SXCZ/2015;5.CH/AHBZ/2015;6.CH/JSXZ/2015;7.HLJFAd15;8.HLJDAd15;9.B1-7;10.764;11.TR59;12.380;13.A-2A;14.SR49;15.340;16.685;17.HEV;18.EDSV。

Note：The nucleic acids were showed in the right upper,amino acids in the left lower;1.SX17;2.CH/HNJZ/2015;3.CH/SDDZ/2015;4.CH/SXCZ/2015;5.CH/AHBZ/2015;6.CH/JSXZ/2015;7.HLJFAd15;8.HLJDAd15;9.B1-7;10.764;11.TR59;12.380;13.A-2A;14.SR49;15.340;16.685;17.HEV;18.EDSV.

表4 pⅢa基因核苷酸與推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比較結(jié)果

注：右上為核苷酸同源性，左下為氨基酸同源性；1.SX17;2.CH/HNJZ/2015;3.CH/SDDZ/2015;4.CH/SXCZ/2015;5.CH/AHBZ/2015;6.CH/JSXZ/2015;7.HLJFAd15;8.HLJDAd15;9.B1-7;10.764;11.TR59;12.340;13.SR49;14.685;15.380;16.HEV;17.EDSV;18.A-2A。

Note：The nucleic acids were showed in the right upper,amino acids in the left lower;1．SX17;2．CH/HNJZ/2015;3．CH/SDDZ/2015;4．CH/SXCZ/2015;5．CH/AHBZ/2015;6．CH/JSXZ/2015;7．HLJFAd15;8．HLJDAd15;9．B1-7;10．764;11．TR59;12．340;13．SR49;14．685;15．380;16．HEV;17．EDSV;18．A-2A.

參考文獻(xiàn):

[1] Monreal G.Poultry science reviews[M].Northants: Science Reviews 2000 Ltd, 1992,4:1-27.

[2] 羅思思,謝芝勛,鄧顯文,等.Ⅰ群禽腺病毒五鄰體基因的克隆及原核表達(dá)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,38(7):154-157.

[3] McFerran J B,Connor T J,Adair B M.Studies on the antigenic relationship between and isolate (127) from the egg drop syndrome 1976 and a fowl adenovirus[J].Avian Pathol J,1978,7(4):629-636.

[4] 張明明,秦愛建,莊驍穎,等．CAG和MLP啟動(dòng)子控制的重組禽腺病毒構(gòu)建[J].畜牧與獸醫(yī),2010,42(3):23-27.

[5] Fessler S P,Young C S H.The role of the L4 33K gene in adenovirus infection[J].Virology,1999,263(2):507-516.

[6] Gelderblom H,Maichlelauppe I.The fibers of fowl adenoviruses[J].Arch Virol,1982,72(4):289-298.

[7] Morin N,Boulanger P.Morphogenesis of human adenovirus type 2:sequence of entry of proteins into previral and viral particles[J].Virology,1984,136(1):153-167.

[8] Jackie P,Wright P J,Sheppard M.A single gene encoding the fiber is responsible for variations in virulence in the fowl adenoviruses[J].J Virol,1996,70(8):5115-5122.

[9] 李茂祥,李紅衛(wèi),殷震,等.減蛋綜合征病毒33K蛋白基因克隆及結(jié)構(gòu)分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),1999,19(3):221-225.

[10] 文艷玲,謝芝勛,黃 琦,等.禽腺病毒1型和4型六鄰體蛋白抗原表位和密碼子偏愛性分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28 (11):17-20.

[11] Farley D C,Brown J L,Leppard K N.Activation of the early-late switch in adenovirus type 5 major late transcription unit expression by L4 gene products[J].J Virol,2004,78(4):1782-1791.

[12] 武 敏.Ⅰ群禽腺病毒JS株Ⅲa蛋白的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備[D].江蘇揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2009.

[13] Kim J N,Byun S H,Kim M J,et al.Outbreaks of hydropericardium syndrome and molecular characterization of Korean fowl adenoviral isolates[J].Avian Dis,2008,52(3):526-530.

[14] Zhao J,Zhong Q,Zhang G Z,et al.Pathogenicity and complete genome characterization of fowl adenoviruses isolated from chickens associated with inclusion body hepatitis and hydropericardium syndrome in China[J].PLoS One,2015,10(7):e0133073.

[15] Li L,Luo L,Wen G,et al.Genome sequence of a fowl adenovirus serotype 4 strain lethal to chickens,isolated from China[J].Genome Announce,2016 ,4(2):e00140-16.

[16] Asthana M,Chandra R,Kumar R.Hydropericardium syndrome:current state and future developments[J].Arch Virol,2013,158(5):921-931.

[17] 袁萬(wàn)哲,李玉保,王建昌,等.雞心包積液-肝炎綜合征的初步研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2016,46(2):157-160.

[18] 袁萬(wàn)哲.科學(xué)防控雞心包積液-肝炎綜合征[J].中國(guó)動(dòng)物保健,2016,18(2):35-35.

[19] 殷 震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997.

[20] Tan P K,Bergelson J C M,Michou A I,et al.Defining CAR as a cellular receptor for the avian adenovirus CELO using a genetia analysis of the two viral fiber proteins[J].J Gen Virol,2001,82(6):1465-1472.