鄧元元，胡 超，朱文娟，陳思宇，蘭時樂

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南長沙 410128）

啤酒糟是啤酒工業(yè)中的主要副產(chǎn)物，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)（王金華，2002）。由于啤酒糟水分含量高，極易腐敗變質(zhì)和造成環(huán)境污染，同時，啤酒糟中還含有大量的纖維素和半纖維素，制約了啤酒糟在飼料工業(yè)中的廣泛應用。目前，國內(nèi)外對啤酒糟的研究主要集中在飼料（Belibasakis，1996）、食用菌栽培原料（葉春苗，2015；朱斌，1996）、飼用酶制劑生產(chǎn)（賓冬梅，2015；杜曉梅，2012） 、魚飼料 （張健，2011）、生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料（王曉力，2016；蔡國林，2015）等領域。低聚木糖是一種具有獨特生理活性的功能性低聚糖，其除了具有低熱、穩(wěn)定、耐酸、安全等良好的理化特性外，還具有提高機體免疫作用（Ayyappan Appukuttan Aachary，2011）、抗腫瘤、促進鈣吸收、降低血脂血壓以及顯著增殖雙歧桿菌和抑菌的功能（Yang，2012；韓玉潔，2006；尤新，2004；鄭建仙，2004），因此，低聚木糖已廣泛應用于食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、飼料工業(yè)和農(nóng)業(yè)領域等。

我國是一個啤酒生產(chǎn)和消費大國，據(jù)報道，每生產(chǎn)100 L啤酒大約產(chǎn)生20 kg啤酒糟（Mussatto，2006）。目前，大部分啤酒糟被用作粗飼料直接飼喂動物，經(jīng)濟效益低下，且啤酒糟中纖維素和半纖維素含量較高，影響動物的消化性和適口性。本文利用碳酸鈉能使纖維素膨脹和雙氧水的氧化作用對啤酒糟進行預處理，研究啤酒糟的預處理工藝，為進一步生產(chǎn)富含低聚木糖的啤酒糟飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 木二糖標準品（純度98%），木三糖標準品（純度98%），木四糖標準品（純度97%），木五標準品（純度96%），購于青島博智匯力生物科技有限公司；碳酸鈉、雙氧水、氫氧化鈣、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國，Merck 公司）；高純氮（純度99%，長沙高科技氣體有限公司）；纖維素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶均由湖南利爾康生物股份有限公司提供。其中纖維素酶10000 U/g，木聚糖酶100000 U/g，甘露聚糖酶8000 U/g。

1.2 主要儀器 色譜柱：COSMOSIL Sugar-D糖分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，北京英萊克科技發(fā)展有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1260，美國，WATERS）；蒸發(fā)光散色檢測器 （ELSD，美國，WATERS）；電子分析天平（KF3102，浙江凱豐集團有限公司）；高速冷凍離心機（CR21G，無錫凱派克斯科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 啤酒糟干燥和粉碎 將新鮮啤酒糟置于80℃恒溫條件下烘干至恒重，用粉碎機粉碎至60～80目。

1.3.2 啤酒糟預處理條件的研究 啤酒糟物理預處理方法的篩選：準確稱取10.00 g啤酒糟粉于200 mL燒杯中，按固∶水＝1∶5加入超純水，攪拌均勻。分別置于110℃、微波、超聲波條件下處理30 min，酶解并干燥后，測定低聚木糖的含量?？疾觳煌锢眍A處理方法對低聚木糖產(chǎn)量的影響。

啤酒糟化學預處理方法的篩選：準確稱取10.00 g啤酒糟粉于200 mL燒杯中，按固∶水＝1∶5加入超純水，攪拌均勻。分別加入質(zhì)量分數(shù)為1%的鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鈣、碳酸鈉以及碳酸鈉（1%）+雙氧水（0.3%），110 ℃條件下處理 30 min，酶解并干燥后，測定低聚木糖的含量?？疾觳煌瘜W預處理方法對低聚木糖產(chǎn)量的影響。

碳酸鈉和雙氧水不同添加量的篩選：分別改變碳酸鈉和雙氧水的添加量，其他條件不變，110℃條件下處理30 min，酶解并干燥后，測定低聚木糖的含量?？疾觳煌妓徕c和雙氧水添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響。

固水比的篩選：分別改變啤酒糟的固水比，其他條件不變，酶解并干燥后，測定低聚木糖的含量?？疾旃趟葘Φ途勰咎钱a(chǎn)量的影響。

預處理溫度的篩選：將啤酒糟分別置于90、95、100、105、110 ℃和 115 ℃條件下處理 30 min，其他條件不變，酶解并干燥后，測定低聚木糖的含量?？疾觳煌A處理溫度對低聚木糖產(chǎn)量的影響。

預處理時間的篩選：將啤酒糟分別預處理15、20、25、30、35 min，其他條件不變，酶解并干燥后，測定低聚木糖的含量。考察不同預處理時間對低聚木糖產(chǎn)量的影響。

1.3.3 啤酒糟的酶解及低聚木糖粗提 準確稱取經(jīng)過預處理并干燥后的啤酒糟粉5.00 g于100 mL燒杯中，按固∶水＝1∶3加入超純水，同時按固體干重加入200 U/g的木聚糖酶，攪拌均勻后，于50℃條件下酶解4 h。加入啤酒糟粉10倍質(zhì)量體積比的超純水，30℃，150 r/min條件下提取30 min，然后在4000 r/min，4℃條件下離心15 min，收集上清液并定容至100 mL，4℃低溫保存。

1.3.4 啤酒糟預處理條件優(yōu)化 根據(jù)預處理單因素試驗結(jié)果，選擇對低聚木糖含量影響較大的預處理因素碳酸鈉添加量、固水比、處理溫度和處理時間進行四因素三水平正交優(yōu)化。正交試驗L9（34）設計見表 1。

表1 正交試驗設計表

1.3.5 低聚木糖含量測定 色譜柱：COSMOSIL Sugar-D 糖分析柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（69：31，V/V）；流速：0.9 mL/min；柱溫：40℃；進樣體積：3μL；蒸發(fā)溫度：78℃；載氣流速：1.6 L/min；載氣壓力：0.5 MP。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒糟物理預處理方法對低聚木糖產(chǎn)量的影響 由圖1可知，啤酒糟不同的預處理方式對低聚木糖產(chǎn)量的影響較大。當以110℃預處理啤酒糟后酶解產(chǎn)物中低聚木糖產(chǎn)量最大，為7.9441 mg/g，微波和超聲波預處理啤酒糟后酶解產(chǎn)物中低聚木糖產(chǎn)量差異不大。因此，選擇110℃作為預處理條件。

2.1.1 啤酒糟化學預處理劑對低聚木糖產(chǎn)量的影響 試驗結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，相同濃度下，不同的化學預處理劑對低聚木糖產(chǎn)量的影響較大。當以碳酸鈉和雙氧水聯(lián)合預處理啤酒糟時，酶解物中低聚木糖的產(chǎn)量最大，達8.5802 mg/g。

2.1.2 碳酸鈉和雙氧水不同添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響 固定碳酸鈉添加量為0.5%（m/m），分別加入不同質(zhì)量體積分數(shù)的雙氧水 （0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.25%），其他條件不變，測定低聚木糖的產(chǎn)量。結(jié)果見圖3。

圖1 不同物理預處理方式對低聚木糖產(chǎn)量的影響

圖2 化學預處理劑對低聚木糖產(chǎn)量的影響

圖3 雙氧水添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響

由圖3可知，當雙氧水添加量為0.1%時，低聚木糖產(chǎn)量最高，為10.2509 mg/g。但隨著雙氧水添加量的增加，低聚木糖產(chǎn)量明顯下降并趨于穩(wěn)定。雙氧水作為一種強氧化劑，在一定濃度范圍內(nèi)能有效破壞纖維素和木質(zhì)素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，增加半纖維素的溶解能力，提高木聚糖酶對半纖維素的可及性，但濃度太高，可能抑制了雙氧水對纖維素和木質(zhì)素交聯(lián)結(jié)構(gòu)的破壞，從而降低了低聚木糖的產(chǎn)生。

選擇雙氧水添加量為0.1%，分別加入不同質(zhì)量分 數(shù)的碳酸鈉 （0.3%、0.5%、0.7%、0.9和1.1%），其他條件不變，測定低聚木糖的產(chǎn)量。結(jié)果見圖4。

圖4 碳酸鈉添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響

從圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著碳酸鈉添加量的增加，低聚木糖產(chǎn)量也隨之增加，當碳酸鈉添加量為0.7%時，低聚木糖產(chǎn)量達到13.9043 mg/g，但碳酸鈉添加量超過0.7%，低聚木糖產(chǎn)量下降。

2.1.3 固水比對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在上述試驗結(jié)果基礎上，分別調(diào)節(jié)啤酒糟的固液比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 和 1∶8，其他條件不變，測定低聚木糖的產(chǎn)量。結(jié)果見圖5。

圖5 固水比對低聚木糖產(chǎn)量的影響

由圖5可知，隨著固液比增加，低聚木糖產(chǎn)量隨之增加。當固液比為1∶6時，低聚木糖的產(chǎn)量達14.4384 mg/g，但固液比繼續(xù)增加，低聚木糖產(chǎn)量下降。

2.1.4 預處理溫度對低聚木糖產(chǎn)量的影響 溫度是影響纖維素和木質(zhì)素降解的主要因素之一，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，纖維素和木質(zhì)素的水解反應和熱解反應加快，但處理溫度過高，水解產(chǎn)物容易發(fā)生縮合反應，從而降低半纖維素的溶出率，影響低聚木糖的產(chǎn)生。圖6結(jié)果表明，預處理溫度為110℃時，低聚木糖產(chǎn)量最高，為17.1814 mg/g。當溫度超過110℃時，隨著預處理溫度的升高，低聚木糖產(chǎn)量反而下降。

圖6 預處理溫度對低聚木糖產(chǎn)量的而影響

2.1.5 預處理時間對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在上述試驗結(jié)果基礎上，將啤酒糟分別處理15、20、25、30、35 min，其他條件不變，測定低聚木糖的產(chǎn)量。結(jié)果見圖7。

圖7 預處理時間對低聚木糖產(chǎn)量的影響

圖7結(jié)果表明，隨著預處理時間的延長，低聚木糖的產(chǎn)量呈先增大后降低的趨勢。當預處理時間為30 min時，低聚木糖產(chǎn)量為16.4982 mg/g，但預處理時間超過30 min，低聚木糖產(chǎn)量下降。原因可能是預處理時間過長，啤酒糟中的半纖維素被水解為木糖、甘露糖以及阿拉伯糖等，從而降低低聚木糖的產(chǎn)量。

2.2 啤酒糟預處理條件優(yōu)化 由表2可以看出，啤酒糟預處理后低聚木糖產(chǎn)量適宜的組合為A3B1C3D2，即 Na2CO30.7%，固液比為 1∶5，預處理溫度為115℃，預處理時間為30 min時，低聚木糖含量為19.4693 mg/g。從極差分析可知，在所選取的試驗條件下，影響低聚木糖產(chǎn)量的主次順序為：溫度＞時間＞碳酸鈉濃度＞固水比，對低聚木糖產(chǎn)量影響最大的因素為預處理溫度，其次為預處理時間，影響最小的是固水比。

表2 正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 采用碳酸鈉和雙氧水聯(lián)合對啤酒糟進行預處理，再采用生物酶解技術(shù)將啤酒糟中的半纖維素轉(zhuǎn)化成低聚木糖，提高了啤酒糟的飼用價值和附加值。

3.2 通過單因素試驗和正交試驗可以得出，利用啤酒糟生產(chǎn)富含低聚木糖飼料添加劑預處理適宜條件為碳酸鈉添加量0.7%，雙氧水添加量0.1%，固液比1∶5，預處理溫度115℃，預處理時間30 min。在此條件下，低聚木糖產(chǎn)量為19.4693 mg/g。

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