朱宇佳，郭 宏，孫 濤，盧江杰，馮尚國(guó)，展曉日，應(yīng)奇才，孟一君，沈晨佳，王慧中

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310036)

類黃酮在植物體內(nèi)具有重要生物學(xué)意義，已知它們有著控制生長(zhǎng)素的運(yùn)輸、根系發(fā)育及向地性、種子萌發(fā)、植物與共生微生物的信號(hào)互作、紫外保護(hù)、抵御外來生物等作用[1]。類黃酮化合物中的花青素和花青素原是植物花、果實(shí)和種子色素的主要成分，其含量及成分的變化易于觀察。同時(shí)，花青素和花青素原合成途徑已成為研究植物次生代謝基因表達(dá)及調(diào)控的模式途徑[2]。在高等植物中，類黃酮類物質(zhì)是廣泛存在的次生代謝物，在植物與環(huán)境的相互作用中起到了重要作用[3]。

查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)是黃酮類物質(zhì)代謝合成途徑中的關(guān)鍵酶，它催化了該途徑的第一步,即1分子的香豆酰CoA(coumaryl-CoA)與3分子的丙酚CoA (malonyl-CoA)生成4，5，7-三羥基黃烷酮(naringenin chalcone)，該產(chǎn)物進(jìn)一步衍生轉(zhuǎn)化構(gòu)成了各類黃酮化合物，進(jìn)而作為多種黃酮類化合物的前體參與下游次生代謝產(chǎn)物的最終形成[4]。查爾酮合成酶是CHS超基因家族的核心酶,該超基因家族還包括一系列通過基因復(fù)制和功能分化衍生出的類CHS(CHS-like)蛋白[5]。從功能角度來看,查爾酮合成酶超基因家族的所有成員均屬于生物聚酮合酶(polyketide synthases，PKS)中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的類型[6-7]。查爾酮合成酶超基因家族成員之間均具有高水平的序列同源性,在結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制上也具有極大的相似性，均是由40～45 ku亞基構(gòu)成的同型二聚體,并且在活化位點(diǎn)處均含有由3個(gè)保守氨基酸Cys-His-Asn構(gòu)成的三聯(lián)體活性中心結(jié)構(gòu)[8-9]。

苦蘵(PhysalisangulataL.)，為茄科(Solanaceae)酸漿屬(Physalis)一年生草本植物，廣泛分布于海拔500～1 500 m的我國(guó)南方地區(qū)。作為一種有著悠久歷史的藥用植物，許多中藥地方志都對(duì)苦蘵的藥用性狀及價(jià)值有著詳細(xì)的描述[10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)最新研究表明，苦蘵主要化學(xué)成分為醉茄內(nèi)酯、酸漿苦素、黃酮、多種酯的甙化合物、生物堿及甾醇等[11]。在苦蘵葉片的提取物中，分離得到一種黃酮苷類化合物myricetin 3-O-neohesperidoside，被證實(shí)是一種新的具有細(xì)胞毒性的黃酮類化合物[12]。此外，苦蘵中也分離出多種其他黃酮類物質(zhì)，它們作為重要的活性物質(zhì)，發(fā)揮著一系列抗氧化活性的作用[13]。由此可見，黃酮類物質(zhì)是形成苦蘵藥效的一類重要物質(zhì)。已有研究表明，CHS是植物黃酮、異黃酮類物質(zhì)合成的限速酶[14]。通過對(duì)苦蘵CHS 基因的研究，有助于進(jìn)一步了解CHS 酶的催化機(jī)理，為進(jìn)一步豐富和完善苦蘵類黃酮合成代謝途徑研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

苦蘵材料取自浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的溫室大棚中，大腸埃希菌取自本實(shí)驗(yàn)室保存菌種DH5α；超表達(dá)載體pDL28-DHA，克隆載體pMD19-T采購自TaKaRa公司。

1.2 化學(xué)試劑

酵母提取物、蛋白胨、氯化鈉、Agar、牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、蔗糖、硫酸鎂、Amp、Kan、X-Gal、IPTG、液氮、三氯甲烷、異丙醇、20×TBE緩沖液、DNA Marker(Trans2000)等。TaKaRa公司T4 DNA連接酶、T緩沖液10×、BSA(10×)、KpnⅠ、SalⅠ、PrimeSTAR Max DNA PolymerasePCR、 MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMDTM19-T Vector Cloning Kit，康為世紀(jì)的高純度質(zhì)粒小提試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、Trizol。

1.3 苦蘵RNA提取以及cDNA模板的合成

取苦蘵果實(shí)，使用Trizol法提取總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。把合格的RNA合成第一鏈cDNA，采用的是康為世紀(jì)的HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒。根據(jù)反應(yīng)體系，加入到PCR管中。輕輕振蕩混勻，短暫離心防止管壁上殘留溶液。42 ℃孵育40 min，85 ℃孵育5 min。冰置冷卻后，-20 ℃保存。用苦蘵Actin引物(表1)PCR擴(kuò)增cDNA，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min; 98 ℃ 30 s; 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min。并用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)得到的cDNA質(zhì)量。

表1 引物名稱及相關(guān)引物序列

1.4 PCR擴(kuò)增目的基因

我們從中選取了CHS家族基因PaCHS1和PaCHS2，基于其全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，并在引物末端添加KpnⅠ、BamHⅠ酶切識(shí)別位點(diǎn)，引物交由生工生物工程股份有限公司合成(表1)。目的基因擴(kuò)增使用TaKaRa的PrimeSTAR Max DNA Polymerase PCR，20 μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并將PCR產(chǎn)物回收。在PCR產(chǎn)物3’端添加dA堿基，將平末端處理為黏性末端。按操作手冊(cè)將試劑加好后在72 ℃下處理15 min，再進(jìn)行電泳，并且瓊脂糖回收。目的片段的純化回收采用的是TaKaRa公司的膠回收試劑盒：MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0。把純化的目的片段與T載體連接，連接使用的是TaKaRa的pMDTM19-T Vector Cloning Kit。按操作手冊(cè)中的反應(yīng)體系加好后16 ℃反應(yīng)30 min。

1.5 重組質(zhì)粒的提取，質(zhì)粒的鑒定及測(cè)序

采用康為世紀(jì)的高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒長(zhǎng)度。將提取的質(zhì)粒37 ℃雙酶切2 h，然后電泳驗(yàn)證酶切條帶，雙酶切體系試劑用量:質(zhì)粒5 μL，T緩沖液10×3 μL，BSA(10×) 2 μL，KpnⅠ 1 μL，BamHⅠ 1 μL，ddH2O加到20 μL。將正確的菌液送到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析(上海桑尼生物技術(shù)有限公司)。

1.6 苦蘵查爾酮合成酶蛋白的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy Proteomics Server上的在線工具Protparam(http://web.expasy.org/protparam/) 對(duì)PaCHS1/2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)；采用SOMPA(http://www.expasy.ch/tools)和Phyre2在線軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/) 分別對(duì)PaCHS1/2基因編碼蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析與3D結(jié)構(gòu)建模； SignalP4.0 Server ((http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行分泌蛋白預(yù)測(cè)；利用在線軟件ProtComp v. 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) 進(jìn)行蛋白定位信號(hào)預(yù)測(cè)。PaCHS1/2蛋白氨基酸序列比對(duì)利用NCBI的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，并通過ClustalW軟件進(jìn)行作圖。通過MEGA 6.1 構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹,bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000次，其他采用默認(rèn)設(shè)置。

1.7 35S亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建

用相同的限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、BamHⅠ將測(cè)序正確的質(zhì)粒和pCAMBIA1300GFP亞細(xì)胞定位載體進(jìn)行雙酶切37 ℃、6 h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并將目的基因片段與GFP1300亞細(xì)胞定位空載酶切片段進(jìn)行切膠回收；將目的片段連接到亞細(xì)胞定位載體GFP1300上，使用的是T4 DNA連接酶，將試劑按表格用量加入PCR管中，輕彈混勻并短暫離心，16 ℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)，然后在含Kan的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h左右。挑選單菌落，將其擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行質(zhì)粒提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒質(zhì)量。采用雙酶切法鑒定質(zhì)粒連接情況，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.8 植物激素處理

采取坐果14 d后的未成熟果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料。將果實(shí)于10 μmol·L-1濃度生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、水楊酸、脫落酸、茉莉酸乙烯中浸泡3 h。取出，以ddH2O漂洗3遍后，凍于液氮中待用。以未處理的果實(shí)為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于苦蘵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的CHS注釋，序列拼接及克隆

搜索苦蘵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到12條與查爾酮合成酶相關(guān)的序列。利用上述得到的12條序列進(jìn)行拼接，得到一條完整的苦蘵CHS編碼基因序列，命名為PaCHS1。針對(duì)得到的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。該基因的長(zhǎng)度均在1 200 bp左右，最終擴(kuò)增出與目的基因長(zhǎng)度相仿的片段。將擴(kuò)增出的DNA片段進(jìn)行切膠回收，TA克隆后送測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得序列相一致。

2.2 苦蘵PaCHS1/2蛋白的理化性質(zhì)

通過DNAStar軟件，分析得到PaCHS1基因具有一個(gè)完整的開放閱讀框(ORF)，共有1 170個(gè)堿基。利用在線軟件ProtParam對(duì)PaCHS1基因的編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，PaCHS1基因預(yù)測(cè)編碼一個(gè)含有389個(gè)氨基酸的蛋白，該蛋白分子式為C1890H3040N508O562S20，分子質(zhì)量為42.5 ku，蛋白等電點(diǎn)pI 6.28，帶正電殘基(Arg+Lys)為43個(gè)，帶負(fù)電殘基(Asp+Glu)為46個(gè)，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為36.57，脂肪系數(shù)為93.47，平均親水性系數(shù)為-0.049。

2.3 PaCHS1蛋白的結(jié)構(gòu)比對(duì)

利用在線SignalP4.1Server 軟件分析發(fā)現(xiàn)，PaCHS1蛋白均不含信號(hào)肽。利用在線工具WOLF PSORT分析PaCHS1蛋白的亞細(xì)胞定位，預(yù)測(cè)結(jié)果相同：分泌系統(tǒng)小泡定位系數(shù)48.0%，質(zhì)膜定位系數(shù)36.0%，細(xì)胞骨架定位系數(shù)16.0%。利用Phyre2在線軟件進(jìn)行蛋白3D結(jié)構(gòu)建模，PaCHS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)模型如圖1所示,結(jié)構(gòu)模型以番茄CHS (Solyc05g053550.2.1)為模板，PsCHS1的211個(gè)氨基酸殘基(占整個(gè)蛋白的54.2%)與對(duì)照模型具有100%的相似度。

2.4 不同植物CHS蛋白序列的比對(duì)及進(jìn)化分析

將克隆得到PaCHS1蛋白序列提交至美國(guó)國(guó)立信息技術(shù)中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行相似性搜索。從搜索結(jié)果中，下載得到了12條與PaCHS1高度同源的蛋白序列。本研究選取的物種包括：甜辣椒(Capsicumannuum， NP_001311934), 番茄(Solanumlycopersicum， NP_001234036.2), 馬鈴薯(Solanumtuberosum，NP_001275296.1), 野茶樹(Camelliasinensis，AGI02994.1), 小金魚草(Misopatesorontium，CAJ44127), 杜鵑花(Rhododendronsimsii，CAC88858), 雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii，XP_012481763.1), 棉花(Gossypiumhirsutum，XP_016747999.1), 矮牽牛(Petuniaxhybrid，BAM17287.1)，烏桕(Triadicasebifera，ARW29605.1), 麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas，NP_001295723.1)和浙江紅山茶(Camelliachekiangoleosa，AFC37242.1)。利用ClustalX2.1軟件，將PaCHS1蛋白序列與下載得到的12條蛋白序列進(jìn)行序列同源比對(duì)，結(jié)果表明，上述蛋白具有極高的序列相似度(圖2)。這進(jìn)一步說明，克隆得到的PaCHS1是苦蘵查爾酮合成酶的編碼基因。

圖1 PaCHS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)模型

圖2 PaCHS1蛋白序列與下載得到的12條蛋白序列的同源比較

為了分析PaCHS1蛋白與其他物種序列的進(jìn)化關(guān)系，通過MEGA6.1軟件(N-J法)構(gòu)建不同植物之間CHS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果表明，克隆得到的兩個(gè)PaCHS1蛋白與1，2下載得到的同源蛋白形成兩個(gè)主要的分支：聚類Ⅰ、聚類Ⅱ和聚類Ⅲ。其中，苦蘵PaCHS1屬于聚類Ⅰ和小金魚草的MoCHS1親緣關(guān)系最近。

2.5 PaCHS1蛋白的亞細(xì)胞定位

利用克隆到的PaCHS1的全長(zhǎng)序列，構(gòu)建35S∶PaCHS1∶GFP載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，轉(zhuǎn)入苦蘵葉肉細(xì)胞中，通過熒光共聚焦顯微鏡，觀察PaCHS1蛋白的亞細(xì)胞定位情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，35S∶GFP空載體定位于細(xì)胞各處，作為陽性對(duì)照。PaCHS1蛋白定位與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，這與生物信息學(xué)分析的結(jié)果基本一致。細(xì)胞質(zhì)定位這一點(diǎn)，與PaCHS1蛋白的生物酶功能相一致(圖4)。

圖3 不同植物CHS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 PaCHS1蛋白的亞細(xì)胞定位

2.6 PaCHS1基因的表達(dá)模式

實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)基因在苦蘵的不同組織器官中的表達(dá)圖譜。結(jié)果表明，PaCHS1基因在各個(gè)器官中都有一定的表達(dá)，其中在果實(shí)中的表達(dá)水平最高，在莖中的表達(dá)水平最低。此外，在葉片，根和花器官中皆有一定的表達(dá)(圖5)。我們又分析了PaCHS1基因在不同激素處理下的表達(dá)變化。結(jié)果表明，PaCHS1基因的表達(dá)水平受到不同激素的調(diào)控。PaCHS1受到茉莉酸(JA)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而受到赤霉素(GA)、乙烯(ethylene)和細(xì)胞分裂素(cytokinin)的強(qiáng)烈抑制。有意思的是，PaCHS1的表達(dá)水平在茉莉酸的處理下上升超過5倍，這說明PaCHS1和茉莉酸密切相關(guān)(圖6)。

圖5 PaCHS1基因在苦蘵不同組織器官中的表達(dá)

圖6 PaCHS1基因在不同激素調(diào)控下的表達(dá)水平

3 討論

苦蘵作為一種歷史悠久的藥用植物，較早地被記載于藥典中。近年來，苦蘵的藥用價(jià)值得到了深入的開發(fā)，多種活性物質(zhì)陸續(xù)得到了鑒定[15]。最近的研究表明，苦蘵中存在的多種抗癌物質(zhì)，如酸漿苦素A和B(physalin A 和B)等,都具有體外的抗腫瘤活性[16-17]。隨著科技的進(jìn)步，更多苦蘵活性物質(zhì)的功能和藥效也將得到解析。黃酮類物質(zhì)，作為一種常見代謝物質(zhì)，廣泛參與植物活性物質(zhì)的合成。同時(shí)，作為其他代謝途徑的前體物，黃酮類物質(zhì)還影響著植物其他次生代謝途徑[18]。

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，我們得到了大量基因序列，從中篩選得到了一個(gè)CHS的編碼序列。本實(shí)驗(yàn)中PaCHS1序列是采用同源克隆方法首次從苦蘵中克隆到CHS的編碼基因，并對(duì)其進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析。PaCHS1與其他物種的CHS有較高的同源度。同時(shí)，其他生物信息學(xué)分析還表明，PaCHS1蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，不含有信號(hào)肽，是非分泌蛋白。而亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)將蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，符合其為代謝酶的特征，滿足CHS蛋白發(fā)揮催化作用的要求[4]。由此可見，所克隆的PaCHS1為查爾酮合成酶編碼基因CHS的同源基因，這為更加全面地研究苦蘵次生代謝的調(diào)控機(jī)制以及黃酮合成與激素之間的相互聯(lián)系提供了參考。

取苦蘵不同部位的組織器官進(jìn)行PaCHS1的表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步研究PaCHS1的作用方式具有一定的參考價(jià)值。定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PaCHS1基因在苦蘵各個(gè)組織中均有表達(dá)，這說明黃酮類物質(zhì)廣泛存在于苦蘵體內(nèi)。有研究表明，不同成熟期金櫻子果黃酮類物質(zhì)的含量和種類有著很大的差別[19]。此外，桃果實(shí)成熟過程中類黃酮類物質(zhì)的積累也存在顯著的變化[20]。我們的結(jié)果表明，PaCHS1的表達(dá)量在不同組織器官中的高低不同，存在明顯的組織特異性。尤其在果實(shí)中，PaCHS1含量顯著高于其他組織。這暗示了黃酮類物質(zhì)的積累，可能與苦蘵果實(shí)成熟密切相關(guān)?？嗵u果實(shí)積累了大量次生代謝活性物質(zhì)，研究果實(shí)發(fā)育成熟相關(guān)P450基因，為我們揭示苦蘵活性物質(zhì)的生物合成提供了基礎(chǔ)[21-22]。

大量研究表明，外源植物激素對(duì)植物次生代謝過程中的主要代謝物積累有著動(dòng)態(tài)的影響。諸如，赤霉素、細(xì)胞分裂素、茉莉酸等植物激素，都能改變藥用植物有效次生代謝物的含量和分布[23-24]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選取了其中常見的植物激素，如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、水楊酸、赤霉素、乙烯、油菜素內(nèi)酯和茉莉酸等，比較了PaCHS1在多種激素處理下的表達(dá)變化。在藥用植物中，茉莉酸甲酯是一種重要的次生代謝調(diào)控分子，外源施加茉莉酸甲酯可以明顯的提高包括黃酮類物質(zhì)在內(nèi)的多種次生代謝物的積累[25-26]。我們發(fā)現(xiàn)，PaCHS1基因在茉莉酸的處理下，表達(dá)水平上升超過5倍。這說明，茉莉酸參與了PaCHS1控制的苦蘵黃酮合成途徑的調(diào)控。

目前對(duì)苦蘵次生代謝功能基因鑒定和克隆尚未見諸報(bào)道，但其他高等植物的次生代謝調(diào)控關(guān)鍵基因的研究已經(jīng)為苦蘵基因的克隆和代謝途徑解析奠定了一定的基礎(chǔ)。對(duì)苦蘵PaCHS1的克隆和表達(dá)譜的研究，可為研究苦蘵以黃酮類物質(zhì)為代表的次生代謝途徑打下基礎(chǔ)，同時(shí)結(jié)合分子育種，為苦蘵活性物質(zhì)的生產(chǎn)做出理論和實(shí)踐的指導(dǎo)。

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