徐 瑞，葉杰君，鄔怡靜，何芯磊，朱友銀，陳文榮，郭衛(wèi)東，廖芳蕾*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 金華 321004； 2.松陽(yáng)縣 松陽(yáng)一中，浙江 麗水 323000；3.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，浙江 金華 321007)

低溫作為植物生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要環(huán)境因素，嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。在低溫條件下，植物細(xì)胞膜透性發(fā)生變化，丙二醛(MDA)數(shù)值越低，植物細(xì)胞受到的傷害越小，植物的抗寒性就越強(qiáng)[3]。柑橘屬植物在我國(guó)的種植面積相對(duì)較大，其用途也十分廣泛，但其抗寒能力卻相對(duì)較弱[4]，寒冷環(huán)境嚴(yán)重制約了柑橘屬植物的產(chǎn)量。

佛手是生長(zhǎng)在熱帶亞熱帶地區(qū)特有的蕓香科植物，屬香櫞變種，無(wú)籽[5]。在我國(guó)其栽培地主要集中分布在浙江、四川等地區(qū)，其中浙江地區(qū)栽培的佛手是開(kāi)發(fā)價(jià)值較高的觀果植物[6-8]。但是佛手的抗寒能力較弱，低溫易引起佛手凍傷致死。本地早、甌柑和處紅柚是三種耐寒性不同的柑橘屬植物。枳是一種抗寒性很高的植物，與柑橘屬植物親緣關(guān)系也很近，常常用作植物抗寒性研究的重要材料。柑橘屬植物的抗寒性差異與生理指標(biāo)的相關(guān)性，仍需要相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)說(shuō)明。

為了適應(yīng)環(huán)境，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化中也形成一套復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，以抵抗各種非生物脅迫。轉(zhuǎn)錄因子就在植物的非生物脅迫中發(fā)揮重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子能與各種應(yīng)激相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列中的順式作用元件相互作用，來(lái)上調(diào)或者下調(diào)下游基因的表達(dá)量[9]。AP2/ERF是與植物的非生物逆境脅迫相關(guān)的基因家族[10]，可分為5個(gè)亞家族，分別是AP-2亞家族、RAV亞家族、DREB亞家族、ERF亞家族和其他亞家族[11]；也可以根據(jù)AP2(DNA結(jié)合功能結(jié)構(gòu)域)分為3類(lèi)，具有單個(gè)AP2的為ERF亞家族[12]。AP2/ERF主要參與了植物的生物性、非生物性的脅迫應(yīng)答[13]、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[14]、發(fā)育調(diào)控[15]及初生代謝物和次生代謝物的調(diào)控[16-17]。AP2/ERF家族的CBF亞家族在低溫脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[18-19]。擬南芥在冷脅迫下被誘導(dǎo)的主要基因是DREB1/CBF，過(guò)表達(dá)的CBF2擬南芥植株可以增加調(diào)節(jié)冷脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量，從而延緩植物葉片的衰老[22]。過(guò)表達(dá)的AtCBF甘薯中，其MDA和H2O2水平降低，增加了甘薯的抗氧化防御體系，耐寒性得到改善[20]。此外，CBF亞家族基因在各種植物如水稻、大豆和小麥中也發(fā)揮重要作用[21]。過(guò)表達(dá)這些基因的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出對(duì)多種非生物脅迫的耐受性。柑橘中已經(jīng)分離到126個(gè)AP2/ERF的同源蛋白[23]，但ERF基因在柑橘屬植物中的抗寒分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)研究柑橘屬植物ERF6轉(zhuǎn)錄因子與5種柑橘屬植物抗寒能力的關(guān)系，并克隆了佛手和枳ERF6基因的啟動(dòng)子序列，對(duì)啟動(dòng)子順式作用元件的分析將有助于探索柑橘屬植物抗寒分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的兩年生青皮佛手(C.medicacv. Qingpi)、本地早(C.aurantiumLinn)、甌柑(C.suavissima. Hort. ex Tanaka)、枳(PoncirustrifoliateRaf.)和處紅柚(C.grandischuhongyou)的盆栽苗為材料。其中佛手盆栽苗系浙江師范大學(xué)佛手實(shí)驗(yàn)基地——浙江錦林佛手有限公司提供，其他盆栽材料均為本實(shí)驗(yàn)室基地自行栽培。實(shí)驗(yàn)材料置于人工氣候室，溫度20 ℃(白天)/28 ℃(夜晚)條件下預(yù)培養(yǎng)3周，而后轉(zhuǎn)至低溫條件下(4 ℃)培養(yǎng)7 d。溫度設(shè)置參照劉祖祺等[24]的方法。

1.2 柑橘屬植物低溫處理及生理特性分析方法

對(duì)5種柑橘類(lèi)植物，在-4 ℃低溫處理下設(shè)置不同的處理時(shí)間，分別為0、12、24、36、48和60 h，摘取植株當(dāng)年生春夏枝由頂梢向下數(shù)5～11葉位的葉片為實(shí)驗(yàn)材料，確保葉片完整、無(wú)病蟲(chóng)害，測(cè)定其MDA含量[25]。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析

在4 ℃低溫條件下對(duì)5種柑橘屬植物分別處理0、12、24、36、48 h，以0 h低溫處理樣品為對(duì)照組[26]。采用CTAB法提取總RNA，再將RNA樣品使用寶生物公司的PrimeScript?Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。按照TaKaRa公司的SYBR Premix EX Taq試劑盒進(jìn)行操作。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，85 ℃延伸5 s，40個(gè)循環(huán)[27]。

1.4 青皮佛手和枳ERF6基因啟動(dòng)子克隆

采用Tail-PCR的方法對(duì)ERF6基因cDNA編碼區(qū)序列的5’端進(jìn)行未知側(cè)翼序列的擴(kuò)增，從而得到基因的啟動(dòng)子序列，3條特異引物由5’端到3’端的排列順序分別為SP3、SP2、SP1(分別為第三輪、第二輪、第一輪巢式PCR特異引物,表1)，PCR反應(yīng)體系及程序參考葉杰君[28]的方法。

采用甜橙基因組庫(kù)(http://citrus.hzau.Edu.cn/orange/tools/blast.p hp)在線獲得枳ERF6(Cs1g14460)基因的信息，在該基因上游約2.0 kb區(qū)域設(shè)計(jì)引物，克隆枳ERF6基因啟動(dòng)子的序列，克隆所用的引物為5′-ACAGCTTCAATCAT AAGGCAGGTG-3′，3′-TGATATTTTAAGTAGCATAT GGCT-5′。

表1 ERF6基因Tail-PCR反應(yīng)引物

PCR反應(yīng)使用Premix ExTaq(version 2 plus dye) (TaKaRa，RR901 A)25 μL反應(yīng)體系。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送公司測(cè)序，利用BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列同源性比對(duì)。

1.5 青皮佛手和枳ERF6基因啟動(dòng)子分析

對(duì)于克隆得到的青皮佛手和枳ERF6基因啟動(dòng)子序列，利用植物順式元件數(shù)據(jù)庫(kù)PlantCARE分析預(yù)測(cè)軟件對(duì)上述啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理時(shí)間對(duì)柑橘屬植物MDA含量的影響

MDA是植物在逆境脅迫下膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量反映組織細(xì)胞在脅迫后的損傷程度。從圖1中可以看出，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，這5種柑橘屬植物葉片中的MDA含量逐漸增加，柑橘屬植株葉片中的MDA含量與處理時(shí)間呈正相關(guān)的趨勢(shì)。在低溫冷脅迫的0～60 h，佛手和處紅柚中MDA的含量明顯要大于甌柑、枳和本地早。而且，這5種柑橘屬植物在低溫處理的60 h內(nèi)，佛手葉片中的MDA含量約增加4倍。處紅柚葉片中的MDA含量增加3倍，甌柑、本地早葉片中的MDA含量增加約3倍。MDA的最終含量由高到低依次為：佛手>處紅柚>本地早>甌柑>枳。MDA的最終含量可以反映植物遭受逆境脅迫的程度，即與抗逆能力呈負(fù)相關(guān)。因而，上述5種植物的抗逆能力大小依次為：枳>甌柑>本地早>處紅柚>佛手。相較于甌柑、枳和本地早，佛手與處紅柚遭受低溫冷害的受損程度較大，其抗寒性也較弱。

圖1 不同低溫處理?xiàng)l件下5種柑橘屬植物葉片中MDA含量變化

2.2 不同處理時(shí)間對(duì)柑橘屬植物ERF6表達(dá)量的影響

低溫處理不同時(shí)間后分析ERF6基因在5種柑橘屬植物的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示。5種柑橘屬植物中ERF6基因表達(dá)量在12 h內(nèi)都被低溫誘導(dǎo)上調(diào)。在低溫脅迫12 h后，佛手ERF6基因表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì)，48 h后表達(dá)量與對(duì)照相比沒(méi)有差異。枳、本地早和處紅柚ERF6基因均在脅迫36 h內(nèi)表達(dá)量上調(diào)。上述結(jié)果說(shuō)明，ERF6基因的響應(yīng)時(shí)間有物種差異，以佛手ERF6對(duì)冷脅迫最敏感，響應(yīng)時(shí)間最短。冷脅迫后，枳的最大誘導(dǎo)表達(dá)量為對(duì)照的316倍。本地早的最大誘導(dǎo)量為對(duì)照的61倍。處紅柚的最大誘導(dǎo)表達(dá)量為對(duì)照的6倍。該結(jié)果表明，枳的ERF6基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)最強(qiáng)烈。低溫脅迫36 h后，枳、甌柑、本地早、處紅柚ERF6的表達(dá)都接近或達(dá)到了48 h內(nèi)的最高值。48 h后，佛手、本地早、處紅柚ERF6基因表達(dá)量下降至接近對(duì)照水平，但枳與甌柑的ERF6表達(dá)量仍然是對(duì)照的2倍，說(shuō)明枳與甌柑的ERF6基因?qū)涿{迫的響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)。根據(jù)ERF6表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)排序，枳>甌柑>本地早>處紅柚>佛手，這與生理指標(biāo)檢測(cè)的抗寒性強(qiáng)弱順序一致。

*，與0 h對(duì)照比較差異顯著(P<0.05)；**，與0 h對(duì)照比較差異極顯著(P<0.01)圖2 低溫脅迫下5種柑橘屬植物葉片中ERF6基因的表達(dá)差異

2.3 佛手和枳ERF6基因啟動(dòng)子序列

將克隆出的佛手、枳ERF6基因啟動(dòng)子的基因序列在NCBI中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其相似度為98%。用PlantCARE在線軟件對(duì)ERF6啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，佛手和枳ERF6基因啟動(dòng)子分析結(jié)果如圖3和表2。兩個(gè)啟動(dòng)子序列中都含有高等植物基因啟動(dòng)子的保守功能元件，表明它是具有潛在活性的啟動(dòng)子。佛手ERF6基因啟動(dòng)子序列有19個(gè)CAAT-box，這些順式元件是控制和調(diào)節(jié)許多真核基因的轉(zhuǎn)錄的重要順式作用因子；佛手ERF6啟動(dòng)子序列有23處也發(fā)現(xiàn)了RNA聚合酶Ⅱ的特異結(jié)合位點(diǎn)TATA-box，該位點(diǎn)是決定基因轉(zhuǎn)錄起始的選擇，為RNA聚合酶的結(jié)合處之一。枳的ERF6啟動(dòng)子序列有33處發(fā)現(xiàn)了多個(gè)CAAT-box；枳ERF6啟動(dòng)子序列有28處發(fā)現(xiàn)了RNA聚合酶Ⅱ的特異結(jié)合位點(diǎn)TATA-box。枳ERF6啟動(dòng)子序列比佛手多出元件LTR和ABRE，LTR是植物冷響應(yīng)基因啟動(dòng)子上對(duì)低溫信號(hào)敏感的順式作用元件，在低溫脅迫下，會(huì)使得冷響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，提高植物的耐寒性。此外，兩段序列中都預(yù)測(cè)到了WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)W-box，以及ABRE、ERE、TATC-box、TCA-element等與激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的順式作用元件。

圖3 佛手和枳ERF6基因啟動(dòng)子序列及結(jié)構(gòu)

元件名稱(chēng)元件功能元件比較佛手(數(shù)目)枳(數(shù)目)A-box順式作用調(diào)節(jié)元件11ARE厭氧反應(yīng)3AT-richsequence最大激發(fā)劑介導(dǎo)激活的元件1ATCT-motif參與光反應(yīng)23Box4光反應(yīng)31CAAT-box啟動(dòng)子增強(qiáng)區(qū)1933CATT-motif光響應(yīng)元件1CCAAT-boxMYBHv1結(jié)合位點(diǎn)12ERE乙烯反應(yīng)元件11F-box11G-Box順式作用調(diào)節(jié)元件參與光反應(yīng)12TATA-box轉(zhuǎn)錄起始元件2328TATC-box順式作用元件參與赤霉素反應(yīng)1TATCCAT/C-motif1TCA-element順式作用元件參與水楊酸反應(yīng)11TGA-element生長(zhǎng)素反應(yīng)元件11TGACG-motif順式作用調(diào)節(jié)元件參與茉莉酸甲酯反應(yīng)1Unnamed__4110circadian參與晝夜節(jié)律調(diào)控144cl-CMA2b光響應(yīng)元件1ABRE順式作用元件參與脫落酸反應(yīng)性2GAG-motif光響應(yīng)元件1GT1-motif光響應(yīng)元件1LTR順式作用元件參與低溫反應(yīng)1LTR順式作用元件參與低溫反應(yīng)MBSMYB結(jié)合位點(diǎn)參與干旱誘導(dǎo)性1P-box赤霉素反應(yīng)元件1Skn-1_motif順式作用調(diào)節(jié)元件需要胚乳表達(dá)1Unnamed__32TC-richrepeats順式作用元素參與防御和壓力反應(yīng)1

3 討論

溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素，低溫對(duì)植物幼苗生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生一定抑制作用?？购允侵参镌谶M(jìn)化中為適應(yīng)低溫脅迫形成的一種重要能力，表現(xiàn)在一些特征化的生理指標(biāo)上。前人在葡萄[29]、菊花[30]、木蘭[31]等植物上以MDA含量等指標(biāo)來(lái)表征抗寒性。本研究也測(cè)定了5種柑橘屬植物經(jīng)低溫脅迫后上述生理指標(biāo)，以比較柑橘屬植物間的抗寒性。在低溫條件下，植物受低溫脅迫其膜脂將過(guò)氧化，MDA作為膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，從膜上釋放并在植物體內(nèi)積累，從而對(duì)植物本身產(chǎn)生傷害，即MDA含量和抗寒性呈負(fù)相關(guān)。在本研究中，通過(guò)對(duì)低溫脅迫下5種柑橘屬植物的MDA含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，其抗寒性強(qiáng)弱為枳>甌柑>本地早>處紅柚>佛手。甌柑與本地早的抗寒能力比較接近，枳在5種柑橘屬植物里抗寒能力最強(qiáng)，佛手最弱，這一結(jié)果與生產(chǎn)實(shí)踐情況一致，也與前人的工作吻合[26,32]。

植物在低溫脅迫下會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的生理變化，涉及到基因表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)等。研究不同植物在低溫脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)差異，為揭示植物抗寒性的分子機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。本課題前期研究中，將佛手材料在4 ℃條件下處理24 h，獲取低溫脅迫后的佛手總RNA，利用抑制消減雜交技術(shù)篩選到與佛手冷脅迫差異的ESTs片段，并對(duì)于克隆得到的冷脅迫誘導(dǎo)基因進(jìn)行測(cè)序比對(duì)鑒定，從而分離出了ERF6基因[33]。此結(jié)果表明，ERF6參與了佛手的低溫脅迫應(yīng)答。在此基礎(chǔ)上，本文測(cè)定了4 ℃下ERF6基因在佛手、枳、本地早、甌柑、處紅柚等5種柑橘屬植物中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ERF6基因在5種植物中的表達(dá)量均會(huì)上調(diào)，確證了除佛手之外，ERF6基因在其他柑橘屬植物中也參與了低溫脅迫應(yīng)答。

本實(shí)驗(yàn)也再次驗(yàn)證了佛手對(duì)低溫條件敏感，在低溫下ERF6基因的表達(dá)量很快上升，隨后逐步下降并恢復(fù)到對(duì)照水平[26,33]。此外，ERF6在低溫處理前后的表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)及響應(yīng)時(shí)間，也和這5種植物的抗寒性強(qiáng)弱呈正相關(guān)。枳在處理36 h內(nèi)ERF6基因上調(diào)倍數(shù)最大，其次為甌柑、本地早、處紅柚，最后為佛手，與生理指標(biāo)測(cè)定的抗寒性結(jié)果一致。因此，ERF6基因在冷脅迫后上調(diào)表達(dá)程度和響應(yīng)周期，可以作為植物抗寒能力強(qiáng)弱的分子特征指標(biāo)。啟動(dòng)子作為驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控元件，在植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，啟動(dòng)子中一些順式作用元件可以與一些反式作用因子相結(jié)合來(lái)調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而使植物對(duì)于外界信號(hào)刺激做出一定的響應(yīng)。ERF亞家族番茄TSRF1可以與病程相關(guān)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，增加水稻的耐旱性[34]。楊樹(shù)轉(zhuǎn)錄因子ERF76參與了鹽脅迫，該啟動(dòng)子區(qū)段長(zhǎng)度不同，轉(zhuǎn)錄活性不同[35]。ERF啟動(dòng)子在柑橘屬植物中的作用機(jī)制報(bào)道較少，啟動(dòng)子中響應(yīng)低溫脅迫的元件分析也較少。本研究克隆了佛手和枳的ERF6啟動(dòng)子，經(jīng)生物信息學(xué)對(duì)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和比較，發(fā)現(xiàn)了在佛手和枳ERF6基因啟動(dòng)子序列上，分布著許多順式作用元件。枳與佛手相比，在啟動(dòng)子區(qū)域多了1個(gè)LTR順式作用元件，2個(gè)ABRE順式作用元件。LTR順式作用元件存在于低溫脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子中，在低溫信號(hào)的刺激下，冷響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，對(duì)調(diào)控植物的低溫響應(yīng)起到重要的作用。LTR(CCGAAA)[36]順式作用元件最初在大麥中被分離，參與植物的低溫應(yīng)答[37]，后來(lái)在楊樹(shù)中再次確認(rèn)了該元件對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答[38]。ABRE是擬南芥中對(duì)冷應(yīng)激反應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件，參與脫落酸應(yīng)答[39]。較多的LTR或ABRE順式作用元件，表明該基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)能力較強(qiáng)，在枳ERF6的啟動(dòng)子里L(fēng)TR、ABRE元件較佛手多，可能使得枳的抗寒性較佛手強(qiáng)。綜上，啟動(dòng)子低溫脅迫響應(yīng)的順式元件的差異，是導(dǎo)致佛手和枳抗寒性差異的原因。

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