牛西遠(yuǎn)， 吳 蕾， 丁小靈， 趙學(xué)軍， 尤和陽(yáng)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是中老年常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。臨床上以靜止性震顫，運(yùn)動(dòng)遲緩，肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)異常為主要表現(xiàn)。PD的主要病理改變是是以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失，黑質(zhì)殘存神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易小體為主要病理改變的神經(jīng)退行性疾病。路易小體是PD 的重要診斷特征，其包含多種成分，而相關(guān)研究表明α-突觸核蛋白是第一個(gè)被確認(rèn)與 PD 相關(guān)的蛋白，是路易小體的重要成分之一[1]，α-突觸核蛋白與路易小體的形成及PD的發(fā)生密切相關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)異常聚集是PD病理學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵事件?，F(xiàn)有的資料表明α-突觸核蛋白異常表達(dá)和聚集是PD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。對(duì)于PD腦外生物學(xué)標(biāo)記物的研究進(jìn)展主要集中在血漿、腦脊液、唾液腺等部位[2，3]。既往研究主要集中在腦脊液，取材不便而且影響較大。此外，血漿和唾液較易獲取，傷害較小，使其成為檢測(cè)該標(biāo)記的理想生物標(biāo)記物。所以此次我們研究集中在血漿和唾液，我們以PD作為研究對(duì)象，以年齡匹配的健康者作為對(duì)照，比較血漿及唾液中 α-突觸核蛋白有無(wú)差異，并比較不同分期、不同病程、疾病進(jìn)展的PD上述蛋白有無(wú)差異，能否成為PD診斷及鑒別診斷、判斷病程、分期的指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年1月～2017年6月省立醫(yī)院門診或住院的PD患者30例(PD組)，其中男18例，女17例，平均年齡(63.8±7.3)歲，年齡匹配的健康體檢者25例(對(duì)照組)，男11例，女14例，平均年齡(64.1±10.8)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)PD組患者符合英國(guó)PD腦庫(kù)的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)Hohen Yahr分期1～4期；(3)采集EDTA抗凝血樣；(4)簽署知情意書(shū)。對(duì)照組為PD患者的健康配偶。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)繼發(fā)性帕金森綜合征患者；(2)其他帕金森疊加綜合征患者；(3)符合癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床癡呆量表評(píng)分≥1分；(4)頭部CT或MRI提示腦內(nèi)器質(zhì)性病變者；(5)嚴(yán)重焦慮、抑郁和精神分裂癥；(6)合并心臟、肺、肝臟、。腎臟、內(nèi)分泌、血液系統(tǒng)嚴(yán)重疾?。?7)患有失語(yǔ)、嚴(yán)重構(gòu)音障礙等影響臨床測(cè)評(píng)的疾??；(8)受唾液腺和口腔病變者；(9)預(yù)計(jì)依從性較差。

1.2 方法 本研究使用病例報(bào)告表，收集患者的基本信息(姓名、性別、年齡)；疾病情況(發(fā)病年齡、病程、疾病進(jìn)展)。我們從每個(gè)PD患者和健康受試者收集最少量的3 ml唾液、血漿。在收集唾液樣本時(shí)，受試者需禁食120 min，在前4 h內(nèi)沒(méi)有吸煙，在過(guò)去12 h內(nèi)沒(méi)有喝酒。 研究中排除了具有血漿污染的樣品。 通過(guò)指示患者將唾液流入無(wú)菌試管中，搜集血漿時(shí)禁食水12 h，用無(wú)菌試管抽取，在4 ℃下以17000 r/min旋轉(zhuǎn)30 min，收集上清液，轉(zhuǎn)移至干凈的管中和唾液一起放置-80 ℃下保存。應(yīng)用統(tǒng)一PD評(píng)定量表運(yùn)動(dòng)部分評(píng)價(jià)PD患者運(yùn)動(dòng)癥狀，用Hoehn-Yahr分期評(píng)估患者疾病受累程度。應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人α-突觸核蛋白水平。用純化的人α-突觸核蛋白(α-SYN)抗體包被微孔板，制成固相抗體(中國(guó) 博研公司)，往包被單抗的微孔中依次加入α-突觸核蛋白，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的α-突觸核蛋白抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物 3，3’、5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。 TMB 在辣根過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的α-突觸核蛋白呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人α-突觸核蛋白濃度。

2 結(jié) 果

2.1 2組各因素比較 PD組血漿及唾液α-突觸核蛋白含量高于對(duì)照組(P<0.05)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 PD血漿及唾液α-突觸核蛋白與各因素的相關(guān)性 PD組血漿α-突觸核蛋白含量與病程(r=-0.025，P=0.888)，Hohen Yahr分級(jí)(r=-0.163，P=0.348)，年齡(r=020，P=0.908)，統(tǒng)一PD評(píng)定量表運(yùn)動(dòng)評(píng)分(r=-0.159，P=0.362)，發(fā)病年齡(r=-0.034，P=0.848)無(wú)相關(guān)性。

PD組唾液α-突觸核蛋白含量與病程(r=-0.78，P=0.655)，Hohen Yahr分級(jí)(r=-0.052，P=0.766)，統(tǒng)一PD評(píng)定量表運(yùn)動(dòng)評(píng)分(r=-0.182，P=0.295)無(wú)相關(guān)性，與年齡(r=-0.425，P=0.011)，發(fā)病年齡(r=-0.336，P=0.048)成負(fù)相關(guān)。

2.3 ROC曲線分析診斷最佳臨界值 應(yīng)用血漿α-突觸核蛋白作為PD標(biāo)記物診斷PD診斷ROC曲線下面積為0.727(P=0.003)，最佳臨界值為157.86 ng/L，敏感性為68.60%，特異性為72.00%。唾液α-突觸核蛋白作為診斷指標(biāo)，ROC曲線下面積為0.785(P=0.00)，最佳臨界值為211.14 ng/L，敏感性為82.90%，特異性為80.00%。

表1 2組間各因素比較

注：與對(duì)照組比較，P<0.05

圖1 唾液α-突觸核蛋白

圖2 血漿α-突觸核蛋白

3 討 論

α-突觸核蛋白為正常人腦組織中一種可溶性蛋白，α-突觸核蛋白在正常生理狀態(tài)下并沒(méi)有細(xì)胞毒性，環(huán)境或者基因的改變易引起α-突觸核蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊，出現(xiàn)寡聚體，纖維性蛋白逐漸增多，繼而形成路易小體，PD的主要病理特征之一是路易小體的出現(xiàn)，其主要成分是α-突觸核蛋白沉積，最終多巴胺神經(jīng)能細(xì)胞程序性死亡使患者出現(xiàn)PD癥狀，隨著檢測(cè)技術(shù)的提高，在腦積液、血漿、唾液中均可以檢測(cè)出α-突觸核蛋白，且發(fā)現(xiàn)PD患者體內(nèi)α-突觸核蛋白較正常對(duì)照組存在差異。Duran等[4]研究發(fā)現(xiàn)，53例未予治療與42例接受治療的PD患者血漿中α-突觸核蛋白水平相似，均高于對(duì)照組，且在該研究中指出在早期疾病的階段α-突觸核蛋白水平的升高，不受抗PD藥物的影響。國(guó)內(nèi)也有研究報(bào)道，PD患者血漿中α-突觸核蛋白寡聚體水平明顯高于對(duì)照組[5]，唯一描述PD中血漿α-突觸核蛋白水平降低的文獻(xiàn)[6]使用了較前不同的技術(shù)，即重組α-突觸核蛋白在大腸桿菌中表達(dá)和免疫印跡定量。而與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同的上述幾組實(shí)驗(yàn)均采用ELISA方法，相比上述方法，ELISA法的定量更具體，在比較健康對(duì)照組和PD患者之間的血漿α-突觸核蛋白中，更容易量化，結(jié)果更線性。雖然有些作者報(bào)道說(shuō)血細(xì)胞沒(méi)有合成α-突觸核蛋白[6]，但 Barbour等[7]盡管只研究了4個(gè)人(健康)，他們?nèi)哉J(rèn)為紅細(xì)胞可能是血漿α-突觸核蛋白的主要來(lái)源。最近的一項(xiàng)研究表明，α-突觸核蛋白通過(guò)靜脈注射的形式通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)致病，這表明血細(xì)胞表達(dá)的α-突觸核蛋白在PD發(fā)病過(guò)程中起潛在作用[8]。PD的病因有老齡化和α-突觸核蛋白，但它們之間的關(guān)系也是充滿爭(zhēng)議，我們的研究結(jié)果顯示血漿α-突觸核蛋白與年齡無(wú)關(guān)，與以前的研究一致[7]。Yanamandra等認(rèn)為神經(jīng)元的死亡或軸突的損傷突觸末端可導(dǎo)致可溶性的釋放α-突觸核蛋白的聚集形式細(xì)胞外，是α-突觸核蛋白生理分泌到細(xì)胞外環(huán)境的證據(jù)[9]。盡管原因不明確，而且我們沒(méi)有在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中研究α-突觸核蛋白水平。因此我們不能提出血漿α-突觸核蛋白作為特定的生物標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)在35個(gè)PD患者中檢測(cè)到血漿α-突觸核蛋白明顯高于對(duì)照組，表明血漿α-突觸核蛋白在PD中仍有它的診斷價(jià)值。

相對(duì)于血漿、腦脊液等，唾液更具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、安全無(wú)創(chuàng)等優(yōu)勢(shì)[10]，有研究表明頜下腺α-突觸核蛋白病理學(xué)檢測(cè)對(duì)于PD診斷的特異性及敏感性達(dá)100%[11]，而頜下腺已被證明參與帕金森病的早期階段[12，13]。既往資料表明人類頜下腺在靜息下產(chǎn)生的唾液占總體積的60%和65%[14]，因此我們選擇唾液中α-突觸核蛋白作為帕金森病診斷的潛在生物標(biāo)志物是具有前景的領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用ELISA方法分析35例PD患者及25例對(duì)照組唾液中α-突觸核蛋白的含量，結(jié)果顯示PD患者唾液α-突觸核蛋白明顯低于對(duì)照組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在本研究中健康受試者與PD之間的年齡無(wú)明顯差異。因此，老齡化對(duì)唾液決定因素的影響并不偏離本研究獲得的結(jié)果。Devic等[15]報(bào)道與對(duì)照組相比，帕金森病患者唾液α-突觸核蛋白水平明顯降低，此外，該研究發(fā)現(xiàn)帕金森病患者唾液α-突觸核蛋白水平與UPDRS(統(tǒng)一帕金森氏病評(píng)分量表)運(yùn)動(dòng)評(píng)分之間的差異，表明其α-突觸核蛋白水平與運(yùn)動(dòng)癥狀嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，但效果未達(dá)到顯著性，與本實(shí)驗(yàn)一致。且他們證實(shí)唾液腺與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)，并參與帕金森病相對(duì)較早的疾病階段[13]，這也解釋了其唾液α-突觸核蛋白與發(fā)病年齡和年齡成負(fù)相關(guān)這一現(xiàn)象[16]，這與本研究一致(r=-0.425，P=0.011)，Al-Nimer等[17]基于20例PD患者也報(bào)道唾液中的α-突觸核蛋白水平顯著低于健康受試者，與本實(shí)驗(yàn)一致的是Devic等[15]和Al-Nimer等[17]這兩項(xiàng)研究均針對(duì)少數(shù)PD患者進(jìn)行的，這是實(shí)驗(yàn)不足之處，但Vivacqua等[18]在2016報(bào)道出在60例PD患者和40例健康受試者相比，PD患者唾液中的α-突觸核蛋白仍減少。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與以前兩次相對(duì)較少數(shù)據(jù)的觀察結(jié)果完全一致，相對(duì)于上述幾項(xiàng)研究，本實(shí)驗(yàn)更能代表東方人群唾液α-突觸核蛋白特點(diǎn)。神經(jīng)病理學(xué)研究表明，在PD的早期階段，聚集α-突觸核蛋白的細(xì)胞主要分布于包括孤束核、迷走神經(jīng)背核的腦干神經(jīng)核里[19]，也可能是在上、下唾液核和副交感唾液神經(jīng)節(jié)里面。這提示α-突觸核蛋白可能從唾液神經(jīng)元的神經(jīng)元細(xì)胞體中擴(kuò)散出來(lái)，沿軸突，到唾液腺上皮細(xì)胞周圍的突觸末端，聚集在唾液腺及唾液中[20]。因此，PD患者唾液中檢測(cè)到的總α-突觸核蛋白濃度降低可能是由于唾液核或唾液神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中α-突觸核蛋白的細(xì)胞內(nèi)和軸突聚集，這可能是PD唾液α-突觸核蛋白濃度較正常對(duì)照組低的原因。

綜上所述，應(yīng)用唾液α-突觸核蛋白診斷PD的ROC曲線方面，敏感性、特異性及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均比血漿α-突觸核蛋白均高，可更適合作為診斷PD的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)年齡、發(fā)病年齡與PD唾液α-突觸核蛋白成負(fù)相關(guān)，可能與唾液腺萎縮后分泌不足有關(guān)，期待以后更多研究證實(shí)。

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