馮 濤

目前臨床上最常見(jiàn)腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)是急性腦梗死，其發(fā)病率占CVD約70%。近些年來(lái)隨著影像技術(shù)及神經(jīng)介入技術(shù)的廣泛應(yīng)用，急性腦梗死超早期血管再通、缺血再灌注對(duì)腦組織半暗帶區(qū)域(Ischemic Penumbra，IP)神經(jīng)元功能的恢復(fù)具有重要意義。腦缺血再灌注損傷也成為急性腦梗死后腦損傷常見(jiàn)病理過(guò)程。

腦缺血再灌注過(guò)程中，腦組織由缺血性改變轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖嘧?，血腦屏障的破壞，細(xì)胞內(nèi)鈣超載及興奮性氨基酸(EAA)毒性作用，過(guò)度的免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織明顯發(fā)生毒性水腫、神經(jīng)元變性、功能喪失。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)是腦內(nèi)的主要免疫應(yīng)答細(xì)胞，對(duì)維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。當(dāng)腦內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，MG快速活化激活，分泌大量神經(jīng)炎性因子，導(dǎo)致腦內(nèi)自身免疫反應(yīng)，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，加劇腦細(xì)胞水腫及神經(jīng)元的損傷。

他汀類藥物通過(guò)抑制三羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)，具有降低VLDL-C與LDL-C，升高HDL-C的作用。近些年來(lái)更多的基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物具有獨(dú)立影響血脂減輕免疫炎癥反應(yīng)，抑制MG過(guò)度表達(dá)的多效性作用。目前有關(guān)他汀類藥物對(duì)MG表達(dá)影響研究較少，機(jī)制不完全清楚。本研究通過(guò)觀察急性腦缺血再灌注損傷后大鼠腦含水量、海馬區(qū)MG的表達(dá)和海馬區(qū)神經(jīng)元病理改變，以及給與瑞舒伐他汀干預(yù)后的變化，探討他汀類藥物腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組 挑選雄性健康SD大鼠96只，清潔級(jí)，體重(210±20)g，鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供。實(shí)驗(yàn)SD大鼠在造MCAO模型前3 d帶回實(shí)驗(yàn)室。避免刺激，實(shí)驗(yàn)室溫度保持21～26 ℃，濕度適宜。自由進(jìn)食水。隨機(jī)將96只SD大鼠平均分正常大鼠為A組，假模型組為B組，模型組為C組，干預(yù)組為D組，每組分為24 h、72 h、7 d、14 d時(shí)間點(diǎn)，造模前禁食水。

1.1.2 藥物與試劑 大鼠MCAO栓線購(gòu)于北京沙東生物技術(shù)有限公司 。Ox42(MG的標(biāo)志)抗體、SP9001試劑盒 、DAB試劑盒購(gòu)于北京中杉生物工程公司 。多聚甲醛由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。磷酸二氫鈉由汕頭市光華化學(xué)廠提供。采用德國(guó)Lecia顯微照像系統(tǒng)采集圖像，應(yīng)用日本奧林巴斯光學(xué)顯微鏡。瑞舒伐他汀鈣(瑞旨片，山東魯南貝特制藥有限公司)，規(guī)格：5 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)：H20080240。

1.2 方法

1.2.1 制備大鼠MCAO模型 SD大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)模型采用改良Zea Longa[1，2]線栓法制備。實(shí)驗(yàn)前大鼠被禁食12 h、禁水4 h。腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)進(jìn)行麻醉，備皮，消毒，鋪巾，左頸正中旁切口，切開皮膚，分離皮下、肌肉組織及迷走神經(jīng)。游離左頸總動(dòng)脈(CCA)，頸外動(dòng)脈(ECA)，頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，采用微型動(dòng)脈夾夾閉CCA和ECA近心端，ECA遠(yuǎn)心端線扎，從ECA將線栓[線栓頭直徑(0.32±0.02) mm]插入ICA進(jìn)顱方推進(jìn)18～20 mm，到達(dá)大腦中動(dòng)脈分叉處，放松微型動(dòng)脈，局部縫合皮膚，外露栓線末端。2 h后線栓拔出4 mm行再灌注。

1.2.2 動(dòng)物處理 正常大鼠組為雄性健康SD大鼠。假模型組大鼠僅在禁食12 h、禁水4 h、麻醉后切開皮膚，分離皮下組織后局部縫合皮膚。模型組即為MCAO大鼠，在造模型后給予生理鹽水2 ml灌胃。干預(yù)組是在MCAO后即給于瑞舒伐他汀鈣2 mg/kg(2 ml溶液)灌胃。各組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射深度麻醉，從左心室加壓生理鹽水灌洗、灌注4%多聚甲醛溶液固定，取腦，4%多聚甲醛液固定24 h，脫水，浸蠟，石蠟包埋，制石蠟冠狀切片(厚度4 μm)。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1 腦含水量測(cè)定 應(yīng)用干濕重方法對(duì)大鼠腦含水量進(jìn)行測(cè)定，腦含水量(%)=(腦濕重-腦干重) /腦濕重×100%。

1.2.3.2 免疫組織化學(xué)染色(SP法)步驟 采用二甲苯對(duì)石蠟冠狀切片進(jìn)行脫蠟2次，酒精脫蠟2次，蒸餾水清洗2次，檸檬酸修復(fù)液高溫修復(fù)，低溫維持，室溫冷卻。采用3%H2O2去離子水孵育，PBS液沖洗后滴加山羊血清封閉液，采用內(nèi)源性生物素進(jìn)行封閉。滴加一抗OX42抗體(1∶100稀釋)4 ℃過(guò)夜。室溫復(fù)溫，PBS液沖洗，滴生物素二抗工作液，PBS液沖洗后滴辣根酶液，孵育，PBS液沖洗后滴加DAB顯色劑，蘇木素復(fù)染，水沖洗后混合液脫色，采用低到高濃度酒精脫水、封片。高倍鏡(×400)下對(duì)大鼠海馬區(qū)MG進(jìn)行觀測(cè)，陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色染色改變，采集圖像，分析陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度值。

1.2.3.3 HE染色步驟 石蠟冠狀切片置烤箱30 min后脫蠟、復(fù)水、蘇木素染色、分化、返藍(lán)、復(fù)染、脫水、二級(jí)透明、封片，高倍鏡(×400)下對(duì)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元進(jìn)行觀測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦含水量改變結(jié)果 A、B各組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)干濕重法測(cè)定腦含水量無(wú)明顯改變(P>0.05)，D、C組大鼠在MCAO后24 h時(shí)腦含水量開始升高，72 h明顯增加，7 d達(dá)到高峰，14 d明顯下降，與A、B組進(jìn)行比較分析，差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，D組24 h、72 h腦含水量與C組進(jìn)行比較，腦含水量下降不明顯，差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，7 d與14 d腦含水量與C組進(jìn)行比較，腦含水量明顯降低，差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，(見(jiàn)表1)。

2.2 大鼠海馬區(qū)MG(OX42)的表達(dá) A、B、C、D組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)MG均有表達(dá)。A、B組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)免疫組化法測(cè)定MG的表達(dá)差異不明顯(P>0.05)。D、C組大鼠在MCAO后24 h時(shí)MG表達(dá)開始增多，72 h表達(dá)增多明顯，7 d表達(dá)達(dá)到高峰，14 d表達(dá)下降明顯，與A、B組進(jìn)行分析比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組MG表達(dá)在4 h、72 h與C組分析比較，MG表達(dá)減少不明顯，差異明顯無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，MG表達(dá)在7 d與14 d與C組分析比較，MG表達(dá)減少明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，(見(jiàn)表2)。

2.3 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色結(jié)果 通過(guò)高倍鏡對(duì)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元觀察發(fā)現(xiàn)A、B組大鼠神經(jīng)元在鏡下未見(jiàn)明顯的神經(jīng)元變性壞死及空泡現(xiàn)象細(xì)。胞整齊排列，胞膜、胞核完整，胞漿清晰。C、D組大鼠神經(jīng)元在鏡下可見(jiàn)明顯的神經(jīng)元變性壞死及空泡現(xiàn)象。視野下細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，細(xì)胞排列及其不整齊，胞膜結(jié)構(gòu)不完整、胞核濃縮，出現(xiàn)渾濁的胞漿，可見(jiàn)大量的神經(jīng)元變性壞死，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象。D組與C組相比，神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，神經(jīng)元變性程度及空泡現(xiàn)象明顯減輕(見(jiàn)圖1～圖4)。

表1 四組大鼠腦含水量比較

注：與C組相比*P>0.05；與C組相比**P<0.05

表2 四組大鼠海馬區(qū)OX42平均積分光密度值

注：與C組相比*P>0.05；與C組相比**P<0.05

圖1 A組海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色(×400)

圖2 B組海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色(×400)

圖3 C組海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色(×400)

圖4 D組海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色(×400)

3 討 論

急性腦梗死是臨床上最常見(jiàn)的腦血管疾病，其致死率、致殘率極高。腦內(nèi)氧與葡萄糖儲(chǔ)備量少，對(duì)缺血、缺氧敏感。完全中斷3～5 min血流即可導(dǎo)致腦神經(jīng)元不可逆損傷。已有資料研究發(fā)現(xiàn)[3]，在急性腦梗死早期梗死區(qū)與IP區(qū)基本相同；3～4.5 h后一半的IP區(qū)再次轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡婀Ｋ绤^(qū)；6～8 h后IP區(qū)消失，全部轉(zhuǎn)為不可逆梗死區(qū)[4]。因此及早開通腦內(nèi)閉塞的動(dòng)脈，對(duì)改善腦缺血半暗帶(ischemic penumbra，IP)區(qū)域神經(jīng)元的功能非常重要[5]。腦缺血再灌注對(duì)神經(jīng)元也造成明顯的損傷，即腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷的病理生理基礎(chǔ)為炎癥反應(yīng)、氧自由基的大量生成、興奮性氨基酸(EAA)毒性、神經(jīng)元胞內(nèi)鈣超載、血腦屏障損傷、線粒體衰減、細(xì)胞抗凋亡基因及凋亡基因的失衡、腦水腫、小膠質(zhì)細(xì)胞大量活化等[3]。其中炎癥反應(yīng)的標(biāo)志是小膠質(zhì)細(xì)胞激活[6]，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高，加劇缺血區(qū)缺血缺氧，刺激更多的氧自由基及縮血管物質(zhì)生成等，加速缺血壞死區(qū)范圍[7]。因此控制腦缺血再灌注過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活，可以保護(hù)神經(jīng)元，降低腦缺血再灌注損傷程度，成為臨床上治療缺血性腦血管病新的治療方法[8，9]。

他汀類藥物多效性是指除了其降脂作用外的作用，主要有減輕免疫炎癥反應(yīng)，抑制血管緊張素Ⅱ受體，減少血管內(nèi)皮素(ET)分泌，抑制金屬基質(zhì)蛋白酶活性，并具有抑制血小板活化等作用。研究表明[10]他汀類藥物的多效性是其抑制膽固醇生物合成通路中間產(chǎn)物異戊二烯類的合成，上調(diào)一氧化氮合酶(eNOS)水平，提高一氧化氮(NO)活性，改變血管內(nèi)皮功能，減少核轉(zhuǎn)錄因子kB表達(dá)，降低炎癥因子C反應(yīng)蛋白的水平[11]，抗血管內(nèi)膜炎癥，穩(wěn)定及固定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，是他汀類藥物廣泛應(yīng)用于臨床上治療心腦血管疾病治療病理生理的基礎(chǔ)。

他汀類藥物抗炎可能與其抑制P-selectin、細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)、E-selectin等表達(dá)，下調(diào)內(nèi)皮素-1(endothelin-1)和血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)與炎性反應(yīng)因子激活等，抑制以 NF-κB 為核心炎癥反應(yīng)通路來(lái)發(fā)揮作用[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)瑞舒伐他汀對(duì)急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦含水量及海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀能明顯減輕急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦含水量，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。對(duì)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色也表明瑞舒伐他汀干預(yù)后神經(jīng)元損傷明顯減輕，凋亡細(xì)胞及空泡明顯減輕，殘存神經(jīng)元數(shù)目比未經(jīng)瑞舒伐他汀干預(yù)的大鼠明顯增多。充分表明瑞舒伐他汀能明顯降低急性腦缺血再灌注損傷，具有腦保護(hù)作用。

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