江 茜 王 英 黃 誠

(1贛南醫(yī)學院護理學院，贛州341000；2贛南醫(yī)學院，贛州341000；3贛南醫(yī)學院生理教研室，贛州341000)

神經(jīng)病理性疼痛 (neuropathic pain,NP) 是由外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、損傷及功能障礙所導致的疼痛[1]。其臨床表現(xiàn)特點為痛覺過敏、痛覺超敏和炎癥區(qū)域持續(xù)性的自發(fā)痛[2]。它是臨床上的常見病和慢性病，在人群中患病率約為6.9%～10%[3]。神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機制至今未完全明了，目前仍無有效的治療手段。臨床上多數(shù)NP病人未能有效緩解疼痛，這給病人及其家庭帶來了沉重的心理、生理及經(jīng)濟負擔[4]。有證據(jù)表明促炎細胞因子如interleukin-6 (IL-6)、interleukin-1β (IL-1β) 和 tumor necrosis factor-α (TNF-α)等在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，最終引起中樞敏化，形成持續(xù)性疼痛[5,6]。此外，在促炎因子 (TNF-α、IL-1β、IL-6等)、細菌和病毒等刺激下，NF-κB被激活，活化的 NF-κB 可調(diào)控 IL-1β、IL-6和 TNF-α等基因的表達[7,8]，兩者構成一種反饋機制共同促進神經(jīng)病理性疼痛的維持與發(fā)展。

臭牡丹 (clerodendron bungei steud,CBS) 是傳統(tǒng)中草藥，屬馬鞭草植物，具有活血散瘀，消腫解毒等功用[9]。研究表明臭牡丹根提取液具有較強的鎮(zhèn)痛作用[10]；但它的作用機制仍不甚清楚，目前國內(nèi)外尚無探討臭牡丹治療NP機制的研究報道。我們的前期實驗結果提示，劑量為30 g/kg的臭牡丹緩解神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠所致的機械痛敏效果最明顯[11]。根據(jù)文獻報道和我們的前期結果，推測臭牡丹可能是通過抑制致炎細胞因子激活的NF-κB信號途徑來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。因此，本實驗擬從細胞因子及NF-κB信號通路入手，采用SNI大鼠模型，選擇30 g/kg的CBS濃度持續(xù)灌胃治療28天，應用Von-Frey設備測定大鼠機械縮足反射閾值，觀察CBS能否緩解SNI大鼠的機械痛敏；通過qPCR和Western blot等實驗探討臭牡丹干預神經(jīng)病理性疼痛的作用機制。

方 法

1.實驗動物

SPF級雄性成年SD大鼠，體重180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[動物中心許可證號：SCXK （湘） 2013-0004]。動物飼養(yǎng)環(huán)境為每天12小時光照/12小時黑暗，50%～55%濕度，23 ± 1℃。實驗期間所有大鼠均自由攝食飲水。大鼠實驗和飼養(yǎng)符合相關規(guī)定。

2.藥材提取

參考王春娟等[12]的方法提取藥材。800 g臭牡丹根（購自亳州市安東藥業(yè)有限責任公司）剪碎，加3 200 ml 80%乙醇（藥材和水1:4比例），用恒溫電熱套100℃煮沸后調(diào)低溫度至60℃ 煮30分鐘，倒出藥液并用四層紗布過濾；臭牡丹根殘渣按照第一遍提取方法再分別提取2次；合并三次濾液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮并蒸發(fā)濾液中的乙醇至無醇味，加適量生理鹽水配置成6 g/ml (即30 g/kg) 濃度。藥液提取成功后分裝置于冰箱-20℃保存。

3.實驗試劑

NF-κB p65亞基多克隆抗體（貨號：4767S）、組蛋白H 3 (D1H2) 抗體（貨號：4499S）購自美國CST公司，TNF-α多克隆抗體 (貨號：ab6671）、IL- 1β多克隆抗體（貨號：ab9722）和β-actin抗體（貨號ab49900）購自英國Abcam公司，IL-6多克隆抗體（貨號：SC-7884）購自美國Santa Cruz公司，HRP標記兔二抗（貨號：7074）購自美國CST公司，亞細胞蛋白質(zhì)組抽提試劑盒（貨號：539790）和PVDF膜購自美國Millipore公司，青霉素（貨號：16051411）購自江西東風藥業(yè)股份有限公司，A SYBR? Select Master Mix（貨號：4472908）購自美國Life technologies公司。

4.實驗儀器

2390型Electronic Von Fery觸覺測痛儀（TC美國），Western Blot（電泳、電轉移）系統(tǒng)（美國Bio-Rad），Lightcycler 480IIReal-Time PCR儀（德國Roche），MK3型酶標儀（美國Thermo），ZNHW-Ⅱ型恒溫電熱套 （上?？旗Z儀器有限公司），SB-1000旋轉蒸發(fā)儀 （上海愛郎儀器有限公司）。

5.神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型制備

參照Decosterd和Woolf等[13]方法制備SNI模型。1%戊巴比妥鈉 (按0.5 ml/100 g注射)腹腔麻醉后，左大腿側邊剪毛，酒精棉球消毒皮膚，劃開皮膚，鈍性分離股二頭肌，暴露出坐骨神經(jīng)分支：腓腸神經(jīng)，腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)，用5.0絲線把脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)緊緊結扎(結扎松緊以結扎的大鼠左后肢微微抽搐為宜)，在脊髓遠側端剪斷，保留大約2～4 mm的遠側殘端，注意術中保持腓腸神經(jīng)完整，傷口局部撒射青霉素粉末預防感染，肌肉和皮膚分兩層縫合。

假手術組（Sham組）只暴露坐骨神經(jīng)，不進行結扎剪斷處理，其他手術操作同前；正常對照組（Ctrl組）不接受手術。

6.實驗分組及給藥

將符合實驗要求的大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為四組 (n = 8)：① Ctrl組；② Sham組；③ SNI組；④ SNI+CBS組。從術后第7天開始，SNI + CBS治療組大鼠灌胃給予30 g/kg 的CBS，連續(xù)灌胃28天，Ctrl組、Sham組和SNI組大鼠則均給予同體積生理鹽水。于術前1 天和術后第7、14、21、28和35天分別測定其行為學變化。并于灌胃28天后，處死大鼠，立即取材。

7.機械縮足反射閾值(機械痛敏)測量

在安靜環(huán)境下，將實驗大鼠放置于透明的有機玻璃箱中（底為1 cm×1 cm的鐵絲網(wǎng)），使大鼠適應15 min。待其安靜后，采用測痛儀由下往上垂直刺激大鼠足底正中皮膚（SNI大鼠術后則刺激大鼠足底外側皮膚），逐漸加大刺激強度，大鼠出現(xiàn)縮足反應（如舔足、抬腿等）時屏幕上自動顯示探針所施壓力大小。該壓力值即為機械縮足反射閾值 (paw withdrawal threshold,PWT)。最大刺激強度不超過90 g，每只大鼠重復5次，每次間隔5 min，取平均值。實驗環(huán)境要求溫度22±1℃，濕度55%～65%。

8.蛋白提取及Western blot檢測蛋白表達

30 g/kg CBS灌胃給藥4周后處死大鼠，快速取手術側L4、L5DRG和脊髓腰膨大部分。按照亞細胞蛋白質(zhì)組抽提試劑盒說明書提取蛋白：將樣本組織 (50 mg) 剪切成小塊，加入預冷的1 ml BufferⅠ后勻漿，4℃旋轉混合10 min后4℃離心，1 000 ×g，10 min，小心吸取上清液，此為細胞質(zhì)蛋白；加入預冷的1 ml BufferⅡ，最大轉速渦旋劇烈振蕩10 s后，4℃旋轉混合30 min，4℃離心，6 000×g，10 min，小心吸取上清液，此為細胞膜蛋白；加入預冷的500 μl Buffer Ⅲ，最大轉速渦旋劇烈振蕩10 s后，4℃旋轉混合10 min，4℃離心，7 000 × g，10 min，小心吸取上清液，即得到核蛋白。提取蛋白后，應用BCA方法測量總蛋白濃度。將分裝的蛋白樣本 (50 μg) 進行SDS-PAGE (10%、12%) 電泳，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉約1 h，按1:200比例稀釋一抗孵育過夜；1:1 000比例稀釋用辣根過氧化物酶標記的與一抗對應的二抗，室溫孵育2 h。最后，使用化學成像發(fā)光成像系統(tǒng)照相，通過Image tool圖像分析軟件讀取目的以及內(nèi)參條帶在PVDF膜上測得的光密度值，計算出目的蛋白量。

9.qPCR檢測mRNA表達

各引物序列由上海生工生物工程公司合成。采用A SYBR? Select Master Mix試劑盒提取總RNA并配制20 μl逆轉錄體系合成cDNA。反轉錄條件：65 ℃ 5 min，37 ℃ 2 min，37℃ 10 min×5 個循環(huán)，70 ℃ 15 min。采用qPCR法進行擴增，qPCR反應體系 20 μl：雙蒸水 (ddH2O)7 μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，SYBR? Select Master Mix 10 μl。反應條件：變形95℃ 10 min；95℃ 10 s，退火61℃20 s，延伸72℃ 25 s，40個循環(huán)。PCR反應后，采用以下的程序進行熔解曲線分析：72 ℃～95 ℃，0.5 ℃，10 s/each。每組重復檢測3次。采用2-ΔΔCt法分析NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平。引物序列如下：

基因Gene引物Primer sequence 5' to 3'TNF-α Forward CCACCACGCTCTTCTGTCTACTG Reverse GGGCTACGGGCTTGTCACTC IL-1β Forward CACCTCAATGGACAGAACATAAGC Reverse TCTTCTTTGGGTATTGTTTGGGA IL-6 Forward AAGACAAAGCCAGAGTCATTCAGAG Reverse GTTGGATGGTCTTGGTCCTTAGC NF-κB p65 Forward CTGTGCGAGTGTCCATGCAG Reverse TTCTTCATGATGCTCTTGAAGGTC Actin Forward CCAACCGTGAAAAGATGACC Reverse ACCAGAGGCATACAGGGACA

10.數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

應用SPSS 17.0、GraphPad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理并統(tǒng)計分析；計量資料以均數(shù)±標準差(±SD)表示，qPCR和Western blot的結果采用one-way ANOVA檢驗，機械縮足反射閾值 (PWT)的結果采用two-way ANOVA和Bonferroni' s post hoc 檢驗。P＜ 0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.CBS對SNI模型大鼠PWT的影響

實驗結果顯示，Ctrl組、Sham組、SNI組和SNI + CBS組在造模前的PWT差異無顯著性。與Sham組相比，SNI組在造模后第7天出現(xiàn)PWT下降 (P＜ 0.001)，提示造模成功，且在造模后的第14、21、28和35天內(nèi)均持續(xù)低于Sham組 (P＜ 0.001)。與SNI組相比，給予劑量為30 g/kg CBS干預后的第 14、21和28天，PWT顯著上升 (P＜ 0.05，見圖1)。

2.CBS對SNI模型大鼠脊髓和DRG的NF-κB mRNA表達的影響

在CBS (30 g/kg) 灌胃治療28天后，與Sham組比較，SNI組大鼠脊髓和DRG中NF-κB p65 mRNA表達明顯增加(P＜ 0.05)；與SNI組比較，SNI +CBS組大鼠脊髓和DRG中NF-κB p65 mRNA表達明顯減少 (P＜ 0.05，見圖 2)。

3.CBS對SNI模型大鼠脊髓及DRG的IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達的影響

在CBS (30 g/kg)灌胃治療28天后，與Sham組相比，SNI組大鼠脊髓和DRG中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達均明顯增加 (P＜ 0.05,P＜ 0.01)；與SNI組相比，SNI + CBS組脊髓及DRG的IL-1β、IL-6和TNF-α的 mRNA表達顯著降低 (P＜ 0.05,P＜ 0.01，見圖 3)。

4.CBS對SNI模型大鼠脊髓和DRG核內(nèi)NF-κB蛋白表達的影響

在CBS (30 g/kg) 灌胃治療28天后，與Sham組比較，SNI組大鼠脊髓及DRG中NF-κB蛋白表達明顯增加 (P＜ 0.05)；與SNI組相比，SNI + CBS組脊髓及背根神經(jīng)節(jié)的NF-κB蛋白表達均顯著下降(P＜ 0.05,P＜ 0.01，見圖 4)。

5.CBS對SNI模型大鼠脊髓及DRG的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達的影響

CBS (30 g/kg)灌胃治療28天后，與Sham組相比，SNI組大鼠脊髓和DRG中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達均明顯增加 (P＜ 0.05,P＜ 0.01)；與 SNI組相比，SNI + CBS組脊髓及DRG的IL-1β、IL-6和 TNF-α蛋白表達顯著降低 (P＜ 0.05,P＜ 0.01，見圖 5)。

討 論

神經(jīng)病理性疼痛是臨床常見病，其病因多樣，發(fā)病機制復雜，臨床治療并無有效根治方法。進一步闡明神經(jīng)病理性疼痛的致痛信號轉導機制，并以此研發(fā)新型有效治療藥物已成為目前國內(nèi)外疼痛醫(yī)學基礎及臨床研究亟待解決的難題。

臭牡丹是一種傳統(tǒng)中草藥，具有祛風解毒，消腫止痛的功效。已有實驗顯示臭牡丹根提取液具有較強的鎮(zhèn)痛作用，且該作用不能被納絡酮所阻斷，提示臭牡丹是通過非阿片受體來發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應的[10]。進一步研究發(fā)現(xiàn)臭牡丹正丁醇提取物可顯著抑制佐劑性關節(jié)炎大鼠的急性和繼發(fā)性足腫脹[14]，且明顯抑制NP大鼠IL-1β、TNF-α的表達[11]。因此，我們在SNI所致的神經(jīng)病理性疼痛模型上探討臭牡丹對其痛敏行為的影響及可能的作用機制。

SNI模型是外周神經(jīng)損傷所誘導神經(jīng)病理性疼痛的經(jīng)典模型之一，該模型因可高度反映臨床疼痛綜合征的一些特點而得到廣泛運用[13]。我們實驗發(fā)現(xiàn)SNI術后動物均存在術側后肢明顯的痛覺超敏，表現(xiàn)為對機械刺激的異常敏感。給予30 g/kg CBS持續(xù)灌胃28 天后PWT顯著上升，提示CBS可緩解SNI所致的神經(jīng)病理性疼痛大鼠機械痛敏。

圖1 CBS對SNI模型大鼠機械縮足反射閾值 (PWT) 的影響(±SD)與Sham組比較,***P ＜ 0.001；與SNI組比較,#P ＜ 0.05Fig.1 Effects of CBS on mechanical paw withdrawal threshold (PWT) in rats with spared nerve injury (SNI)(±SD)***P ＜ 0.001,compared to Sham group,#P ＜ 0.05,compared to SNI group.

圖2 CBS對SNI大鼠脊髓及DRG中NF-κB mRNA表達的影響 (n = 5,±SD)與Sham組比較,*P ＜ 0.05；與SNI組比較,#P ＜ 0.05Fig.2 qPCR analysis of NF-κB mRNA expression in the L4-L6 spinal cord and DRG (n = 5,±SD)*P ＜ 0.05,compared to Sham group,#P ＜ 0.05,compared to SNI group.

圖3 CBS對SNI大鼠脊髓及DRG中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達的影響 (n = 5,±SD)與 Sham 組比較 ,*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與 SNI組比較 ,#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01Fig.3 qPCR analysis of IL-1β,IL-6 and TNF-α mRNA expression in the L4-L6 spinal cord and DRG (n = 5,±SD)*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,compared to Sham group,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01,compared to SNI group.

圖4 CBS對SNI大鼠脊髓及DRG中核內(nèi)NF-κB蛋白表達的影響(n = 8,±SD)與 Sham 組比較 ,*P ＜ 0.05；與 SNI組比較 ,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01Fig.4 Western blot analysis of NF-κB protein expression in the L4-L6 spinal cord and DRG (n = 8,±SD)*P ＜ 0.05,compared to Sham group,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01,compared to SNI group.

圖5 CBS對SNI大鼠脊髓及DRG中核內(nèi)IL-1β,IL-6和TNF-α蛋白表達的影響 (n = 8,±SD)與 Sham 組比較 ,*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與 SNI組比較 ,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01Fig.5 Western blot analysis of IL-1β、IL-6 and TNF-αprotein expression in the L4-L6 spinal cord and DRG (n = 8,±SD)*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,compared to Sham group,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01,compared to SNI group.

神經(jīng)病理性疼痛的形成和發(fā)展是多個因素相互級聯(lián)的復雜過程。多重證據(jù)表明促炎細胞因子參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與維持過程，其中IL-1β、IL-6、TNF-α與疼痛關系尤為密切[5]。研究表明，在傷害性刺激作用下，組織受損傷后神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活后釋放相應促炎細胞因如IL-1β、IL-6和TNF-α的表達顯著升高[15～17]，在實驗研究中我們觀察到SNI大鼠脊髓和DRG中 IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平均明顯升高；而給予30 g/kg CBS持續(xù)28天灌胃后可顯著降低IL-1β、IL-6 和TNF-α的mRNA及蛋白的表達，這與Wang X、Gopalsamy等學者的研究結果具有一致性[15～17]。以上我們的研究結果提示CBS可能通過下調(diào)IL-1β、IL-6以及TNF-α的基因和蛋白表達來抑制外周和中樞炎癥反應，減輕中樞敏化，從而緩解NP的痛敏行為。

此外，在促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)、細菌和病毒等刺激下，NF-κB被激活，活化的NF-κB又可調(diào)控IL-1β、IL-6和TNF-α等基因的表達[7,8]，兩者構成一種反饋機制共同促進神經(jīng)病理性疼痛的維持與發(fā)展[18,19]。為觀察CBS對SNI誘導的神經(jīng)病理性疼痛大鼠NF-κB的變化影響，我們采用qPCR和Western Blot方法檢測大鼠脊髓和DRG NF-κB的mRNA及細胞核內(nèi)蛋白表達變化情況。實驗結果表明經(jīng)大鼠術側坐骨神經(jīng)分支部分結扎剪斷后，脊髓和DRG NF-κB的mRNA及蛋白表達均顯著增加，而CBS灌胃給藥28天后，NF-κB的mRNA及蛋白表達顯著下調(diào)，為此，我們認為CBS可能是通過抑制NF-κB信號通路來發(fā)揮對NP的鎮(zhèn)痛作用。緣由神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機制是多因素、多條信號通路相互級聯(lián)的復雜過程，要完全明確CBS對神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛機制，仍需進一步的實驗研究加以證實。

綜上所述，基于文獻報道和我們的實驗結果，提示CBS作用于神經(jīng)病理性疼痛的可能機制是通過抑制NF-κB信號途徑，進而抑制NF-κB信號分子所誘導的炎癥介質(zhì)致炎細胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的mRNA和蛋白表達來實現(xiàn)的。

參 考 文 獻

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