井維鑫，劉 娜，王 蘭

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，鎘成為水系表層沉積物中含量最高的重金屬之一[1]。水生生物通過呼吸、攝食等方式吸收環(huán)境中的重金屬，并在體內(nèi)積累[2]，通過食物鏈進(jìn)入人體引起慢性中毒，進(jìn)而影響人類的健康[3-6]。

雙殼類屬于底棲動(dòng)物，具有極高的濾水速率[7]，可反映水體中重金屬的污染狀況[8]，是監(jiān)測水體重金屬污染物的有效指示生物[9]。動(dòng)物組織的金屬含量與生物標(biāo)志物具有相關(guān)性[10]，鰓作為呼吸器官與水環(huán)境直接接觸，是毒物的主要靶器官[11]，重金屬通過鰓組織到達(dá)其他組織器官[12]。研究表明，鎘通過Ca2+通道穿過細(xì)胞膜進(jìn)入機(jī)體，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基和活性氧（ROS），ROS與體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞膜損傷，并影響多種酶的活力，對(duì)生物體造成威脅[13]?？寡趸甘且活惐O(jiān)測環(huán)境污染或環(huán)境變化的重要生物標(biāo)志物，且在不同環(huán)境、不同物種、不同組織均有明顯差異[14]。

本研究采用亞慢性毒性試驗(yàn)方法，研究鎘暴露和鎘清除后背角無齒蚌（Anodonta woodiana）超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和過氧化氫酶（CAT）活性的變化情況，旨在為篩選合適的生物標(biāo)志物進(jìn)行重金屬監(jiān)測提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

背角無齒蚌（濕質(zhì)量為（90.51±20.01）g；體長為（9.08±0.64）cm；殼頂高為（3.82±0.36）cm），購于山西省太原市五龍口水產(chǎn)品批發(fā)市場。購回后，用曝氣48 h的自來水清洗，去除表面附著物以及泥沙等雜質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)室條件下（水溫為（14.65±0.31）℃；溶解氧為（9.75±0.26）mg/L；電導(dǎo)率為（6.67±0.32）μS/cm；pH 值為 8.34±0.12），對(duì)背角無齒蚌馴養(yǎng)42 d，前21 d不喂食以使體內(nèi)代謝廢物排出體外，后21 d投喂小球藻（喂食數(shù)量為3.5×104個(gè) /只）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)96 hCd2+的LC50（134.9 mg/L）設(shè)置高濃度組 1.349 mg/L（1/100 LC50）和低濃度組0.337 mg/L（1/400 LC50）共 2 個(gè)鎘（Cd2+）處理組，同時(shí)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組，每個(gè)組選取大小相近且健康的60只蚌進(jìn)行染毒。

試驗(yàn)分為2個(gè)階段：前28 d為鎘暴露期，即將背角無齒蚌在不同濃度Cd2+溶液中染毒處理28 d；后28 d為鎘清除期，將之前Cd2+染毒處理28 d的背角無齒蚌移入到清水中飼養(yǎng)至56 d。不同試驗(yàn)階段均是2 d換水一次，每次換水后進(jìn)行喂食，定時(shí)檢查蚌的死亡情況，隨時(shí)挑出死亡個(gè)體（死亡標(biāo)準(zhǔn)為貝殼長久張開，不閉合，斧足異常伸展，受刺激后不收縮[15]）。

1.2.2 樣品制備 每7 d取材一次，各試驗(yàn)組隨機(jī)取5只蚌，解剖取鰓組織，用濾紙吸凈表面水分，稱質(zhì)量后用液氮速凍后保存于-80℃冰箱中備用。同時(shí)以預(yù)冷的PBS緩沖液在冰上制備20%的鰓組織勻漿液，并于4℃下離心，取其上清液，暫保存于冰上。

1.2.3 測定方法 采用羥胺法測定T-SOD、可見光法測定CAT、羥胺法測定GPx、考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。酶活測定的試劑盒購于南京建成生物工程研究所，抗氧化酶活力與蛋白含量的檢測用多功能酶標(biāo)儀（SpectraMaxM5，美國MD公司）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），并應(yīng)用Tukey's test將處理組與對(duì)照組進(jìn)行比較（?表示差異顯著（P＜0.05），?? 表示差異極顯著（P＜0.01））。試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘暴露與鎘清除對(duì)背角無齒蚌鰓組織SOD活性的影響

與對(duì)照組相比，SOD活性在背角無齒蚌鰓組織鎘暴露期的低濃度組（0.337 mg/L），21，28 d 被顯著或極顯著抑制（P＜0.05 或 P＜0.01），但是 7，14 d未被抑制；高濃度組（1.349 mg/L）鎘暴露期被極顯著抑制（P＜0.01），且在 28 d抑制效果最明顯（P＜0.01）。鎘清除期，低濃度組（0.337 mg/L）SOD活性在35 d被極顯著抑制（P＜0.01），之后隨著清除時(shí)間的延長，SOD活性逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平；而高濃度組（1.349 mg/L）在鎘清除期內(nèi)，SOD活性被極顯著抑制（P＜0.01），且在 42 d 達(dá)最低值，其低于鎘暴露期的各組水平（圖1）。

2.2 鎘暴露與鎘清除對(duì)背角無齒蚌鰓組織GPx活性的影響

在背角無齒蚌鰓組織中，GPx活性與對(duì)照組相比，在鎘暴露期，低濃度組（0.337 mg/L）除 21 d 無顯著性差異外，其余各組GPx活性均顯著或極顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）；高濃度組（1.349 mg/L）在7 d 被極顯著抑制（P＜0.01），在 14，21，28 d 極顯著或顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），且在 21 d 達(dá)到最大值。在鎘清除期，低濃度組（0.337 mg/L）在49，56 d 被極顯著誘導(dǎo)（P＜0.01），35，42 d 無顯著性差異；高濃度組（1.349 mg/L）的鰓組織GPx活性，在 35，56 d 組被極顯著誘導(dǎo)（P＜0.01），在 42，49 d無顯著性變化（圖2）。

2.3 鎘暴露與鎘清除對(duì)背角無齒蚌鰓組織CAT活性的影響

鎘暴露期低濃度組（0.337 mg/L）背角無齒蚌鰓組織除7 d CAT無顯著性差異外，其他測定時(shí)間均被顯著抑制（P＜0.05）；高濃度組（1.349 mg/L）除 7 d無顯著性差異外，14，21，28 d時(shí)CAT活性顯著或極顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。鎘清除期，低濃度組（0.337 mg/L）除 56 d 無顯著性差異外，各測定時(shí)間均被顯著或極顯著抑制（P＜0.05 或 P＜0.01）；高濃度組（1.349 mg/L）在 35，56 d 與對(duì)照組相比無顯著性差異，42，49 d CAT活性均被顯著或極顯著抑制（P＜0.05 或 P＜0.01）。在鎘清除期 56 d，低濃度組、高濃度組CAT活性均恢復(fù)至對(duì)照組水平（圖3）。

3 討論

鰓是軟體動(dòng)物的呼吸器官，是污染物作用的早期靶點(diǎn)[16]。在生物體內(nèi)，只有SOD是一種以自由基為底物的抗氧化酶，具有清除機(jī)體內(nèi)活性氧自由基的作用，從而使細(xì)胞免受損害[13，17-18]。研究表明，背角無齒蚌經(jīng) 4.22～67.45 mg/L Cd2+處理 24 h 后，發(fā)現(xiàn)鰓組織SOD被極顯著誘導(dǎo)[19]；經(jīng)5，50 mg/L Cd2+組脅迫14 d后鰓組織SOD活力顯著升高[20]；5 μg/L Cd2+脅迫30 d后，鰓組織由于氧化應(yīng)激，SOD活性顯著升高，40 μg/L Cd2+脅迫30 d后，SOD活性顯著下降[12]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOD活性在試驗(yàn)測定時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)為被抑制，可能是因?yàn)閯?dòng)物體長時(shí)間暴露在較高濃度Cd2+（0.337，1.349 mg/L）狀態(tài)下，體內(nèi)被誘導(dǎo)產(chǎn)生了較多的超氧陰離子（O2-·），而過多的O2-·影響了SOD基因的表達(dá)，進(jìn)而促使酶蛋白的合成受阻、酶活性下降[21]。

GPx是生物體普遍存在的一種抗氧化物酶。Cd2+與GPx的活性部位硒代（半）胱氨酸（Se-Cys）結(jié)合，一方面降低了Cd2+對(duì)機(jī)體的毒性影響，另一方面導(dǎo)致其活性部位發(fā)生改變、GPx失活[22]。此外，Cd2+與GPx前體結(jié)合使GPx的合成受到抑制，從而導(dǎo)致H2O2，OH-的積累，使機(jī)體受到損傷[23]。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，背角無齒蚌以5 μg/L Cd2+脅迫30 d后，鰓組織GPx活性顯著升高，40 μg/L Cd2+脅迫30 d后，GPx活性與對(duì)照組相比無明顯差異[12]；以 4.22～67.45 mg/L Cd2+處理24 h發(fā)現(xiàn)，鰓組織GPx活性僅在16.82 mg/L Cd2+處理組表現(xiàn)為顯著升高，其余濃度組與對(duì)照組無明顯差異[19]。本試驗(yàn)在鎘暴露7 d后，高濃度組（1.349 mg/L）活性相對(duì)于對(duì)照組顯著上升，當(dāng)處理時(shí)間延長，GPx活性略有下降，但相對(duì)于對(duì)照組仍表現(xiàn)為顯著升高。原因是由于Cd2+進(jìn)入機(jī)體后，導(dǎo)致ROS的大量生成[24]，抑制了SOD的活性，使得機(jī)體內(nèi)H2O2的含量不斷增高，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的GPx來清除過量的H2O2[25]。

CAT是一種含血紅素的酶，存在于線粒體和抗氧化物酶體中，CAT能迅速分解H2O2，生成H2O和O2[26]。背角無齒蚌用較低濃度（5～40 μg/L）[12]或較高濃度（4.22～67.45 mg/L）[19]Cd2+脅迫后，可極顯著誘導(dǎo)鰓CAT的活性升高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Cd2+在0.337 mg/L 可顯著抑制 CAT活性，1.349 mg/L 可顯著誘導(dǎo)CAT活性升高。當(dāng)大量的Cd2+進(jìn)入機(jī)體并誘導(dǎo)其產(chǎn)生活性氧自由基時(shí)，SOD活性被抑制，進(jìn)而促使機(jī)體內(nèi)H2O2含量升高[24]。H2O2的升高也誘導(dǎo)了機(jī)體內(nèi)CAT的基因表達(dá)及活性，提高H2O2的分解速率[27]。

在試驗(yàn)鎘清除期56 d，鰓組織SOD活性在低濃度組（0.337 mg/L）恢復(fù)至對(duì)照組水平，而高濃度組（1.349 mg/L）仍極顯著低于對(duì)照組水平（P＜0.01）；鰓組織GPx活性低、高濃度組仍極顯著高于對(duì)照組水平（P＜0.01）；鰓組織 CAT活性低、高濃度組均恢復(fù)至對(duì)照組水平。本研究結(jié)果表明，在鎘低濃度污染被清除后，背角無齒蚌具有一定的適應(yīng)或恢復(fù)能力，而當(dāng)受外界環(huán)境高濃度鎘脅迫后，即使這種污染被清除后，機(jī)體適應(yīng)和恢復(fù)的能力也極其有限。鎘對(duì)背角無齒蚌的健康影響，在很大程度上取決于暴露劑量的高低和暴露時(shí)間的長短[28]。

綜上所述，不同濃度鎘暴露后，背角無齒蚌鰓組織SOD活性被抑制，GPx活性被誘導(dǎo)，CAT活性在低濃度組中表現(xiàn)為抑制，在高濃度組中表現(xiàn)為誘導(dǎo)。表明背角無齒蚌機(jī)體對(duì)鎘污染具有一定的恢復(fù)能力。因此，背角無齒蚌抗氧化酶活性的變化能夠反映生物體受污染物脅迫的程度，可作為生物標(biāo)志物用于指示水體鎘污染狀況。

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