張 寧，溫銀元，王金榮，賀美林，蘭 敏

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

苦參（Sophora flavescens）是我國傳統(tǒng)中藥材之一，別名草槐、好漢枝、地槐、鳳凰爪、苦骨、川參等，為豆科植物槐屬，藥用部位是干燥根，生長于向陽的路旁處和草地、山坡，在全國各地均有分布。經(jīng)分離鑒定，苦參根中主要含有的化學(xué)成分有兩大類：黃酮類和生物堿類化合物，其也是苦參藥理作用的主要藥效成分[1]。其中，黃酮類化合物從苦參根中已分離的有32種，部分為黃酮醇類、黃酮類、查耳酮類、異黃酮類和雙環(huán)系黃酮類，主要是二氫黃酮和二氫黃酮醇類[2]?？鄥⒃谥嗅t(yī)臨床具有抗增殖、抗炎、清熱解毒、燥濕利尿、祛風(fēng)、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和促凋亡特性、殺蟲等作用[3-4]。KIM等[5]研究發(fā)現(xiàn)，苦參對糖尿病有一定的抑制作用。

本研究利用數(shù)據(jù)庫中苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的序列信息，通過生物信息學(xué)的方法系統(tǒng)研究苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族的序列信息，包括8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶所編碼氨基酸的目的和特性，旨在為進(jìn)一步進(jìn)行苦參的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶蛋白家族序列來源于NCBI 數(shù)據(jù)庫 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov），分別是：SfN8DT-1 （序列號為 AB325579.1），SfN8DT-2（序列號為 AB370330.1），SfN8DT-3（序列號為AB604222.1）。

1.2 方法

采用SignalP v4.1對8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶蛋白家族序列進(jìn)行信號肽預(yù)測；采用TargetPServer v1.1進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；使用ProtParam對苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用TargetP進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位和多肽性分析；通過NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析鑒定；利用TMHMM對跨膜區(qū)域進(jìn)行分析；采用SOPMA對苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白進(jìn)行分析，預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。采用在線分析軟件Swissmodel進(jìn)行分析，并建模三級結(jié)構(gòu)；使用MEME和NCBI-CDD對苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白序列進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白一級結(jié)構(gòu)分析

利用ProtParam對苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測[6]，結(jié)果列于表1。由表1可知，8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白質(zhì)序列在 NCBI數(shù)據(jù)庫中的序號分別是：B1B3P3.1（SfN8DT-1），B1B5P4.1 （SfN8DT-2），BAK52289.1（SfN8DT-3）；SfN8DT-1和 SfN8DT-3基因編碼氨基酸數(shù)相等，SfN8DT-2基因編碼氨基酸數(shù)最少；SfN8DT-1 蛋白的分子質(zhì)量最大（4.61 ku）；SfN8DT-2蛋白的分子質(zhì)量最小 （4.57 ku）；SfN8DT-2 和SfN8DT-3的理論等電點較接近。3個SfN8DT蛋白的理論等電點在 8.93～9.23，均為堿性氨基酸。根據(jù)SfN8DT的不穩(wěn)定系數(shù)發(fā)現(xiàn)，8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因蛋白都為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)大于40）[7]。親水性指數(shù)表明，8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的蛋白是疏水性蛋白[8]，其脂溶指數(shù)[9]也都大于100。利用TargetP蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因蛋白可知，其均分布于葉綠體。

表1 8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶蛋白家族理化性質(zhì)分析

2.2 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

使用SOPMA軟件預(yù)測苦參SfN8DT蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表2所示?？鄥fN8DT的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角組成，其中，SfN8DT-1，SfN8DT-2和SfN8DT-3中各組分?jǐn)?shù)量從大到小排序均為：α-螺旋＞無規(guī)則卷曲＞延伸鏈＞β-轉(zhuǎn)角；結(jié)構(gòu)元件所占比例表明，α-螺旋和無規(guī)則卷曲占比較高[10]（圖1）。結(jié)果表明，該家族蛋白二級結(jié)構(gòu)組成基本相同。

表2 苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)

2.3 苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族跨膜域以及信號肽分析

利用TMHMMServer v2.0預(yù)測SfN8DT蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)蛋白家族分析發(fā)現(xiàn)，8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白都存在多個跨膜位點，SfN8DT-1存在9個跨膜折疊組成，第1個位置N點位于124；SfN8DT-2存在9個跨膜折疊組成，第1個位置N點位于121；SfN8DT-3存在7個跨膜折疊組成，第1個位置N點位于153。SfN8DT家族蛋白結(jié)構(gòu)的特點是含有N端親水區(qū)和中間至C端疏水區(qū)，苦參SfN8DT所編碼的蛋白具有典型的N端胞質(zhì)區(qū)-跨膜結(jié)構(gòu)域-C跨膜結(jié)構(gòu)域特征（圖2），SfN8DT-3N端胞質(zhì)區(qū)最大位于152個氨基酸位置[11]。使用SignalP v4.1進(jìn)行蛋白分析預(yù)測（圖3），結(jié)果表明，該蛋白家族不存在信號肽[12]。

2.4 蛋白結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)分析

苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白使用NCBI中CDD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測。由圖4可知，8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白都存在保守結(jié)構(gòu)域，屬于PT_UbiA_HPT1超級蛋白家族[13]。將3個鑒定的8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白全長序列提交MEME數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白保守域預(yù)測[14]（圖5），進(jìn)一步采用 Swiss-model在線工具對 SfN8DT-1，SfN8DT-2和SfN8DT-3進(jìn)行同源建模。由圖6可知，SfN8DT-1，SfN8DT-2和 SfN8DT-3這 3個蛋白的模型在三維結(jié)構(gòu)上沒有明顯區(qū)別[15]。

3 結(jié)論

本研究從生物信息學(xué)角度對苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白進(jìn)行了詳細(xì)的分析，結(jié)果表明，3個8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白的理論等電點在 8.93～9.23，均為堿性氨基酸；根據(jù) SfN8DT的不穩(wěn)定系數(shù)發(fā)現(xiàn)，SfN8DT蛋白都為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)大于40）。親水性指數(shù)表明，8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族編碼的蛋白是疏水性蛋白，其脂溶指數(shù)都大于 100；SfN8DT-1，SfN8DT-2 和 SfN8DT-3中各組分?jǐn)?shù)量從大到小排序均為：α-螺旋＞無規(guī)則卷曲＞延伸鏈＞β-轉(zhuǎn)角，其中，α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)元件占比較高，該家族蛋白二級結(jié)構(gòu)組成基本相同。8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白都存在多個跨膜位點，不存在信號肽；8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白都含保守結(jié)構(gòu)域，屬于PT_UbiA_HPT1超級蛋白家族，SfN8DT-1，SfN8DT-2和SfN8DT-3這3個蛋白的模型在三維結(jié)構(gòu)上沒有明顯區(qū)別，結(jié)果為更深層次探究8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白在黃酮類化合物合成過程奠定了理論基礎(chǔ)。

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