武莎莎，張 彬，杜俊杰，王鵬飛，張建成，穆霄鵬，傅鴻博

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

歐李（Cerasus humilisBge.）又名鈣果，為薔薇科櫻桃屬[1]，是我國特有的一種優(yōu)良灌木果樹，分布于我國的黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山東、山西等省區(qū)，多生長在向陽山坡或沙丘邊緣，資源相當(dāng)豐富[2]。其耐寒、耐旱、耐瘠薄，固土保水作用強(qiáng)，山西省已將其列為經(jīng)濟(jì)林木樹種[3]。歐李果實(shí)含有糖、蛋白質(zhì)、維生素和各種礦質(zhì)元素及抗氧化等人體營養(yǎng)和保健活性物質(zhì)[4]。隨著果樹轉(zhuǎn)基因研究的不斷深入，其基因功能的驗(yàn)證要求能在大多數(shù)的木本果樹本身或類似的果樹上進(jìn)行，但多數(shù)木本果樹結(jié)果晚、體積大、驗(yàn)證時(shí)間長、成本高。

歐李具有結(jié)果早、樹體小的特點(diǎn)，作為木本果樹的基因功能驗(yàn)證模式植物優(yōu)勢明顯。農(nóng)大7號品種是新選育的一個(gè)鮮食歐李品種，其外觀漂亮、香味濃郁、酸甜適口，且結(jié)果早、豐產(chǎn)性強(qiáng)[5]，但若要作為轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證的模式品種，必須首先建立其高效再生體系。盡管近年來歐李再生體系的研究已有報(bào)道[6-9]，但再生體系因品種其差異較大。

本研究以歐李農(nóng)大7號為材料，探討其愈傷組織建立的技術(shù)，旨在為歐李高效再生體系的建立提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)歐李資源圃農(nóng)大7號品種當(dāng)年生枝條中上部平展無病害葉片。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體處理 將剪下的葉片放在流動水下沖洗30 min，用洗潔精清洗3～5 min，之后用清水沖洗至無泡沫為止。在無菌條件下，將材料用0.1%升汞消毒9 min，再用75%酒精消毒15 s，然后用滅好菌的無菌蒸餾水沖洗3～5次，最后用無菌濾紙擦干。將葉片去掉葉邊緣及葉柄，剪成長寬為1 cm大小方塊，近軸端接觸培養(yǎng)基。

1.2.2 單因素 NAA，2，4-D對愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)

生長素 NAA 設(shè) 0.5，0.8，1.2 mg/L 等 3 個(gè)質(zhì)量濃度，2，4-D 設(shè) 0.5，0.8，1.0，1.2，1.5 mg/L 等 5 個(gè)質(zhì)量濃度，在MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 多因素NAA，6-BA在不同培養(yǎng)基中對愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn) 選MS，1/2 MS和改良MS這3種培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，其中，改良MS培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上鈣鹽、鐵鹽含量各增加了25%，生長素 NAA 質(zhì)量濃度設(shè)為 0.4，0.8，1.2 mg/L，6-BA設(shè)0.5，1.0，1.5 mg/L，按正交試驗(yàn)L9（33）進(jìn)行處理設(shè)計(jì)。

1.2.4 多因素NAA，TDZ在MS培養(yǎng)基中對愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn) 生長素 NAA 設(shè) 0.2，0.5，0.8 mg/L等 3 個(gè)質(zhì)量濃度，分裂素 TDZ設(shè) 1.5，3.5，5.5 mg/L等3個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行完全交叉試驗(yàn)，在MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.5 愈傷組織增殖試驗(yàn) 將培養(yǎng)25～30 d、大小為0.3～0.5 cm3的愈傷組織分別轉(zhuǎn)接到單因素培養(yǎng)基和多因素培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖試驗(yàn)。其中，單因素為 MS＋2，4-D，2，4-D質(zhì)量濃度設(shè)為 0.6，0.8，1.0，1.2 mg/L；多因素為 MS＋2，4-D＋6-BA，其中，2，4-D 質(zhì)量濃度設(shè)為 0.6，0.8，1.0，1.2 mg/L，6-BA質(zhì)量濃度設(shè)為 0.2，0.5mg/L，進(jìn)行交叉試驗(yàn)。培養(yǎng) 30d后觀察愈傷增殖情況。

培養(yǎng)基 pH 值為 5.8～6.0、蔗糖 30 g/L、瓊脂6.5 g/L。外植體接種后先暗培養(yǎng)10 d，后再在光下培養(yǎng)，30 d后觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。培養(yǎng)條件（25±1）℃，光暗周期18 h/6 h，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件包對試驗(yàn)觀測到的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素NAA，2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表1可以看出，單因素NAA，2，4-D均有較高誘導(dǎo)率，2，4-D的誘導(dǎo)率整體上高于 NAA；2，4-D誘導(dǎo)的愈傷組織時(shí)間快，顏色呈黃白狀，質(zhì)量濃度0.8 mg/L相對較好（圖1）；NAA誘導(dǎo)的愈傷組織呈綠色，質(zhì)地疏松，質(zhì)量濃度0.5 mg/L相對較好。整體得出，單因素誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)中，以MS＋0.8 mg/L 效果最好。

表1 單因素對愈傷組織的誘導(dǎo)

2.2 多因素NAA，6-BA在不同培養(yǎng)基中對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2 多因素NAA，6-BA在不同培養(yǎng)基中對愈傷組織的誘導(dǎo)

葉片接種3 d后開始微微隆起，7 d左右主葉 脈傷口處膨大，10 d左右有小顆粒狀愈傷組織出現(xiàn)，20～30 d有大量愈傷組織產(chǎn)生。1/2 MS培養(yǎng)基中產(chǎn)生愈傷時(shí)間最早，其次依次為MS和改良MS，但是1/2 MS誘導(dǎo)的愈傷疏松，易老化。MS、改良MS產(chǎn)生的愈傷呈黃綠、嫩綠色，質(zhì)地緊密。30 d統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果列于表2。對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異性顯著比較，結(jié)果如表3，4所示。

表3 方差分析結(jié)果

表4 單因素多重比較 %

由表3，4可知，農(nóng)大7號歐李品種在葉片愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，B因素NAA對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響達(dá)顯著水平，A因素（培養(yǎng)基）和C因素（6-BA）對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響均達(dá)到極顯著水平，說明3個(gè)因素均有重要作用，同時(shí)各因素的主次關(guān)系為A＞C＞B。對A因素進(jìn)行多重比較表明，A1極顯著高于A2和A3，因此，A1即MS培養(yǎng)基對歐李葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果最好；生長素B2極顯著高于B3和B1，即NAA質(zhì)量濃度0.8 mg/L效果最好；C2和C1極顯著高于C3，且C2又顯著高于C1，因此，C2即6-BA 1.0 mg/L的效果最好。通過分析以及表型觀察得出，農(nóng)大7號葉片愈傷組織誘導(dǎo)以MS＋NAA 0.8 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L 組合最好（圖 2）。

表5 多因素NAA，TDZ在MS培養(yǎng)基中對愈傷組織的誘導(dǎo)

從表5可以看出，NAA和TDZ誘導(dǎo)的愈傷組織整體呈綠色，質(zhì)地偏硬、脆，最適培養(yǎng)基為NAA 0.5 mg/L＋TDZ3.5 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)到 98.3%（圖 3）。

2.4 MS培養(yǎng)基下不同生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織增殖的影響

從表6可以看出，單一添加2，4-D增殖愈傷組織中以質(zhì)量濃度0.8 mg/L效果最好，過高或過低都不利于增殖和質(zhì)地的優(yōu)化。同時(shí)添加2，4-D和6-BA增殖愈傷組織中，高質(zhì)量濃度2，4-D和低質(zhì)量濃度6-BA下增殖的愈傷組織偏黃、質(zhì)地疏松，而在低質(zhì)量濃度2，4-D和高質(zhì)量濃度6-BA下增殖的愈傷組織偏綠且質(zhì)地緊密。本試驗(yàn)中，MS＋6-BA0.2mg/L＋ 2，4-D0.6 mg/L為最佳愈傷組織增殖培養(yǎng)基。

表6 歐李農(nóng)大7號愈傷組織增殖情況

3 討論

愈傷組織具有高度再分化的能力，經(jīng)過長期繼代保存而不喪失其胚性并且具有旺盛的自我增殖能力，可用于建立大規(guī)模的愈傷組織無性系，通過愈傷組織的再分化建立高頻率植株再生體系，進(jìn)而為通過遺傳轉(zhuǎn)化改良品種奠定基礎(chǔ)[10]。愈傷組織的形成過程受植物基因型、外植體類型及理化狀態(tài)、培養(yǎng)基成分、光照條件、糖源濃度等諸多因素相互作用的影響[11]。培養(yǎng)基種類以及生長調(diào)節(jié)劑又是主導(dǎo)因素[12]。因此，本試驗(yàn)通過不同培養(yǎng)基、不同生長調(diào)節(jié)劑和濃度來篩選農(nóng)大7號愈傷組織的最適培養(yǎng)條件，為以后歐李分子機(jī)制、遺傳轉(zhuǎn)化和種質(zhì)資源保存奠定基礎(chǔ)。

愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)是內(nèi)源激素和外源激素共同作用的結(jié)果，通過附加外源激素可以調(diào)節(jié)總的激素水平，從而完成由外植體脫分化形成愈傷組織的過程[13]。植物愈傷組織培養(yǎng)過程中，植物基因型、培養(yǎng)基及激素配比等為主要因素[14]。植物組織培養(yǎng)中，不同植物的遺傳特性、生物學(xué)特性都不同，因而，適宜物種組織生長的營養(yǎng)條件也會有所不同，甚至同一植物的不同部位、同一部位的不同生長時(shí)期對營養(yǎng)的要求也會有所變化[15]。因此，在組培過程中首先需要選擇一個(gè)最適培養(yǎng)基。

劉琳[16]用 MS，N6，B5，WPM這 4 種培養(yǎng)基進(jìn)行對比試驗(yàn)，結(jié)果表明，MS和B5都可作為鈣果微體快繁的培養(yǎng)基，但使用B5培養(yǎng)基，試管苗易出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，故基本培養(yǎng)基用MS。本試驗(yàn)進(jìn)一步證明，葉片誘導(dǎo)愈傷組織質(zhì)量最好的為MS培養(yǎng)基。杜研[17]研究發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織誘導(dǎo)中，MS＋KT0.3 mg/L＋NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，農(nóng)大3號葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到97.8%。本試驗(yàn)中，單因素 2，4-D0.8mg/L誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織時(shí)間早、數(shù)量多；多因素MS＋NAA 0.8 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L 誘導(dǎo)的愈傷組織效果好，但是當(dāng)2，4-D質(zhì)量濃度高于1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織數(shù)量少，形態(tài)呈水漬黏狀。在只添加2，4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長的愈傷組織比較松軟，呈黏液化和泡狀，一般不易分化，且再生頻率很低[18]，本試驗(yàn)雖然證明了單用2，4-D也能產(chǎn)生較好的愈傷組織，但在歐李樹種上應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。本試驗(yàn)添加6-BA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織呈黃綠色、質(zhì)地疏松，但是高質(zhì)量濃度的6-BA（超過2.0 mg/L）會抑止愈傷組織增殖，愈傷組織在后期會發(fā)生嚴(yán)重褐化，是否褐化作為植物組培能否成功的關(guān)鍵因子之一[19]，在試驗(yàn)中應(yīng)避免材料發(fā)生褐化。本試驗(yàn)中，褐化原因可能是由于歐李作為一種灌木果樹，本身分生能力較強(qiáng)，因此，歐李不需要高濃度分裂素。TDZ分裂能力較強(qiáng)，在添加TDZ的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色偏深綠，質(zhì)地較硬。姚婷等[8]研究表明，離體葉片不定芽再生的最適植物生長調(diào)節(jié)劑組合為改良 MS＋TDZ4.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L，再生率達(dá)到63.1%，且超過20 d時(shí)就可產(chǎn)生不定芽，本試驗(yàn)也曾使用了該配比，但未得到不定芽，可能是由材料的不同所引起的。

在愈傷組織誘導(dǎo)增殖過程中，生長素和分裂素種類及濃度都起著舉足輕重的作用。在合適的濃度下，使用2，4-D誘導(dǎo)增殖愈傷組織數(shù)量多、速度快、質(zhì)地穩(wěn)定，因此，可用于材料的保存；6-BA和生長素NAA或2，4-D結(jié)合的愈傷組織質(zhì)地顏色可以進(jìn)一步用于不定芽的再生。TDZ分裂能力最強(qiáng)，但是沒有6-BA穩(wěn)定。

參考文獻(xiàn)：

［1］俞德浚.中國果樹分類學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1982：63-77.

［2］丁偉，杜俊杰，王鵬飛，等.黃土丘陵溝壑區(qū)不同立地類型歐李生長差異分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（5）：764-768.

［3］陳赫男.砂石山區(qū)優(yōu)良水土保持先鋒樹種歐李引種及其效益研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［4］朱華.歐李果酒的初步研究[J].釀酒科技，2004（4）：97-98.

［5］王鵬飛，曹琴，杜俊杰，等.鮮食歐李新品種‘農(nóng)大7號’[J].園藝學(xué)報(bào)，2013，40（1）：181-182.

［6］肖遠(yuǎn)志，黃國林，張平.新技術(shù)在觀賞植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（15）：20-22.

［7］ WANG R F，HUANG F L，ZHANG J，et al.Establishment of a high-frequency regeneration system in Cerasus humilis，an important economic shrub[J].Forest Research，2016，21（5）：244-250.

［8］姚婷，張開春，閆國華，等.歐李離體葉片再生體系的建立[J].果樹學(xué)報(bào)，2012，29（4）：589-592，713.

［9］李勁，蔣澤平，梁珍海.優(yōu)系歐李莖葉愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生[J].江蘇林業(yè)科技，2006（1）：12-15.

［10］郭曉博，張曉麗，李俊華，等.山藥愈傷組織研究進(jìn)展[J].北方園藝，2014（24）：183-186.

［11］崔凱榮，戴若蘭.植物體細(xì)胞胚發(fā)生的分子生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2000：329-397.

［12］張海龍，劉艷軍，黃俊軒，等.影響冰燈玉露組培苗形態(tài)建成因子的研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，23（7）：17-20.

［13］高兵.“嘎拉”蘋果葉片愈傷組織的誘導(dǎo) [J].北方園藝，2017（9）：88-92.

［14］孫瑞芬，李天然，李堃，等.草莓組培快繁及葉片誘導(dǎo)植株再生的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2002，17（4）：49-53.

［15］GELLA R，ERREA P.Application of in vitro therapy for ilarvirus elimination in three Prunus species[J].Journal of Phtopathology，1998，146（8）：445-449.

［16］劉琳.鈣果初代組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（2）：247.

［17］杜研.鈣果組織培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)的研究 [D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［18］李代麗，康向陽.植物愈傷組織培養(yǎng)中內(nèi)外源激素效應(yīng)的研究現(xiàn)狀與展望[J].生物技術(shù)通訊，2007（3）：546-548.

［19］劉藝平，王政，牛佳佳，等.不同糖源及蔗糖質(zhì)量濃度對牡丹愈傷組織褐化的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（3）：103-106.