趙 霞 ，王長(zhǎng)彪 ，趙興華 ，劉 江 ，韓 斌 ，任永康 ，牛瑜琦 ，唐朝暉

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界上重要的糧食作物之一[1]。近幾年，小麥病害發(fā)生嚴(yán)重，如白粉病、各種銹病等，抗病育種一直是育種家們的研究?jī)?nèi)容，因此，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的小麥新品種勢(shì)在必行[2-3]。傳統(tǒng)的育種方式費(fèi)工費(fèi)時(shí)，從分子水平改良種質(zhì)資源的方式正一步步受到人們的重視[4]。近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)[5]在小麥研究中取得重大進(jìn)展[6]。

生物信息學(xué)綜合應(yīng)用生物學(xué)知識(shí)、數(shù)學(xué)模型及計(jì)算機(jī)運(yùn)算，對(duì)核酸序列和蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，旨在獲得具有生物學(xué)意義的信息[7]。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基因的電子定位發(fā)展了起來(lái)[8]，其是利用日益豐富的生物信息學(xué)資源，運(yùn)用生物信息學(xué)方法，將目的基因定位到染色體實(shí)際位置上的一種技術(shù)，較傳統(tǒng)的定位技術(shù)更簡(jiǎn)便、更快捷、成本更低[9]。分子生物學(xué)與生物信息學(xué)技術(shù)的結(jié)合為小麥的研究提供了有效的方法[10]。

本研究旨在尋找與小麥抗白粉病、抗銹病相關(guān)的SSR和STS標(biāo)記，構(gòu)建小麥抗病分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)，并將其定位在中國(guó)春小麥的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，把抗病標(biāo)記進(jìn)行物理定位，為基因精細(xì)定位、克隆基因等方面奠定基礎(chǔ)。然后對(duì)能夠成功定位的基因進(jìn)行有效的序列分析、功能預(yù)測(cè)、功能注釋及KEGG分析等生物信息學(xué)研究，以期獲得與小麥白粉菌、銹菌互作進(jìn)程中的基因表達(dá)信息，為研究小麥病害的發(fā)病機(jī)理、發(fā)掘抗病相關(guān)新基因及抗病基因的精細(xì)定位和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步培育抗病小麥品種具有重要的理論實(shí)踐意義。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的51份小麥材料中，41份由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，分別是運(yùn)旱618、運(yùn)旱 20410、石家莊 8 號(hào)、SY-9571、良星 99、良星 66、濟(jì)麥 22、山農(nóng) 20、百農(nóng) 64、蘭考 906、保豐 104、揚(yáng)麥 21、中麥 247、皖麥 38、中麥 175、舜麥 1718、京冬 8 號(hào)、MY559、周麥 28、周麥 30、周麥 32、京冬17、京冬 18、京冬 24、長(zhǎng) 4640、長(zhǎng) 6135、長(zhǎng) 6452、長(zhǎng)6878、太 5902、太 10604、晉麥 66、晉麥 70、晉麥84、晉太 170、晉太 182、寧麥 5 號(hào)、石麥 15、濟(jì)南17、洛旱2號(hào)、河農(nóng)6425、中優(yōu)9507；3份由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，分別是 98M71，UC1041，Moro；7 份由西北農(nóng)林科技大學(xué)提供，分別是先麥12、豐尤8號(hào)、百農(nóng) 121、鄭 132、鄭 369、蘭考 165、阜 0608。

從相關(guān)文獻(xiàn)中查找小麥抗白粉病、抗銹病相關(guān)標(biāo)記，共368個(gè)。

1.2 方法

小麥抗病基因定位：在Linux平臺(tái)上，將368個(gè)抗病標(biāo)記采用re-PCR方法將其定位到中國(guó)春小麥全基因組序列中，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并利用MapChart2.1軟件進(jìn)行作圖。

使用Fgenesh軟件對(duì)能進(jìn)行電子定位的序列進(jìn)行功能基因預(yù)測(cè)。使用Blast2go軟件對(duì)獲得的功能基因進(jìn)行基因的GO注釋及KEGG的代謝通路分析。

從預(yù)測(cè)出的功能基因中隨機(jī)選取159對(duì)引物進(jìn)行真實(shí)PCR檢測(cè)。采用CTAB法提取小麥幼苗葉片DNA，隨后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，再進(jìn)行 PCR反應(yīng)（10 μL 體系：1.5 μL 50 ng模板 DNA，1 μL 10×buffer，0.2 mol/L dNTP，0.12 U Taq聚合酶，0.75 μmol/L引物），反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火45 s（退火溫度據(jù)引物溫度而定，一般55～60℃），72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)。最后用8%非變性聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)，上樣2 μL并在220 V電壓下運(yùn)行1 h后，銀染后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，讀帶后利用NTSYS軟件的UPGMA聚類分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，探究遺傳規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子定位結(jié)果

統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有247個(gè)與抗病相關(guān)的基因被定位到了相應(yīng)染色體上，其中定位到2B染色體上的最多。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，有的同一個(gè)標(biāo)記定位在不同染色體上或同一個(gè)標(biāo)記在同一條染色體的不同部位。具體對(duì)分子標(biāo)記的電子定位效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中，在1A染色體上的分子標(biāo)記定位率（定位率即成功進(jìn)行電子定位后每條染色體上的總標(biāo)記與未定位前每條染色體上的總標(biāo)記的百分比）為60%，1B為 65.5%，1D為 72.7%，2A 為 57.9%，2B 為 64.3%，2D 為 82.1% ，3A 為 55.6% ，3B 為 66.7% ，3D 為12.5%，4A 為 84.6%，4B 為 80.0%，4D 為 38.5%，5A為 37.5%，5B 為 69.2%，5D為 89.5%，6A 為 91.7%，6B 為 40.0% ，6D 為 6.7% ，7A 為 50.0% ，7B 為51.7%，7D為90.9%。電子定位的結(jié)果表明，電子定位能夠?yàn)榭共』虻目寺?、表達(dá)和功能研究等提供重要的信息，也可為進(jìn)一步研究小麥抗病機(jī)制等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2.2 小麥基因功能預(yù)測(cè)

將可以成功進(jìn)行定位的247個(gè)小麥抗病基因利用基因功能預(yù)測(cè)軟件Fgenesh進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)出108個(gè)功能基因。

2.3 小麥功能基因的序列分析

將所得的108個(gè)基因的核酸序列用Blast2go軟件進(jìn)行功能注釋分類，其中，成功注釋的有73個(gè)功能基因，未成功注釋的有35個(gè)功能基因。共得到89條GO術(shù)語(yǔ)信息，其中，屬于生物學(xué)途徑P的有51條，細(xì)胞組件C的23條，分子功能F的有15條。GO注釋分類的結(jié)果表明，在生物學(xué)途徑中最多的是生物過(guò)程與細(xì)胞過(guò)程，其次就是各種代謝過(guò)程，如有機(jī)物代謝過(guò)程、細(xì)胞代謝過(guò)程、初級(jí)代謝過(guò)程、大分子代謝過(guò)程等；從細(xì)胞組成的角度來(lái)看，大多數(shù)功能基因都是在細(xì)胞、胞內(nèi)、細(xì)胞器及細(xì)胞質(zhì)中起作用的；在分子功能中，作用最多的是分子功能，其次是催化活性和結(jié)合功能，充分說(shuō)明小麥細(xì)胞內(nèi)正常活動(dòng)離不開(kāi)包括輔基結(jié)合、蛋白結(jié)合、輔酶結(jié)合、ATP結(jié)合、DNA結(jié)合和RNA結(jié)合等各種結(jié)合功能及酶的催化活性。

2.4 基于KEGG的代謝通路分析

運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲得的功能基因進(jìn)行代謝通路分析，共有16個(gè)功能基因編碼的13種酶涉及到11個(gè)生物化學(xué)途徑。相關(guān)的酶有差向異構(gòu)酶、硝基苯磷酸酯酶、轉(zhuǎn)化酶、α-葡萄糖苷酶、二磷酸合酶、水解酶、磷酸酶、磷酸合酶。參與的生物化學(xué)途徑有戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、氨基苯甲酸鹽降解、淀粉和蔗糖代謝、萜類骨架生物合成、脂肪酸伸長(zhǎng)率、光合生物固碳、Th1和Th2細(xì)胞分化、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、半乳糖代謝、磷酸戊糖途徑、抗生素生物合成。本研究認(rèn)為，在小麥的各種代謝途徑中，主要以淀粉、蔗糖代謝為主。具體代謝分析結(jié)果列于表1。

表1 小麥功能基因基于KEGG的代謝通路分析

2.5 聚類分析

構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示，從結(jié)果可以看出，其遺傳相似系數(shù)為 0.66～0.90，平均為 0.78。從圖1可看出，濟(jì)麥22和山農(nóng)20親緣關(guān)系最近。在相似系數(shù)為0.75時(shí)，可以把51份材料分為Ⅸ大類，其中，第Ⅰ類中運(yùn)旱618與運(yùn)旱20410是高感病品種，可以推測(cè)與其聚在一起的有可能是高感病品種；第Ⅲ類中大部分品種都是高抗品種[11-15]；第Ⅳ類中除了MY559是高抗葉銹病品種外[16]，其余都是來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)的高抗條銹病與高抗白粉病的品種[17]；第Ⅵ類中SY-9571是感病品種[11]；第Ⅷ類與第Ⅸ類都是長(zhǎng)麥系列。以上聚類信息為小麥抗病基因標(biāo)記在小麥品種鑒定中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，是小麥品種在分子水平上表現(xiàn)出的遺傳多樣性，為小麥多種品種共同抗病奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

種業(yè)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的源頭，發(fā)展小麥種業(yè)是保障我國(guó)糧食安全的根本[18]。由于長(zhǎng)期的人工選擇和栽培，導(dǎo)致小麥大量?jī)?yōu)異基因丟失，導(dǎo)致當(dāng)今小麥遺傳基礎(chǔ)狹窄、脆弱，易受病蟲(chóng)害的侵染，限制了小麥產(chǎn)量的提高[19]。本研究通過(guò)電子定位技術(shù)將368個(gè)小麥抗病標(biāo)記定位到中國(guó)春小麥全基因組序列中[20]，并利用Fgenesh，Blast2go軟件以及KEGG等生物信息學(xué)手段對(duì)小麥抗病基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，這些為小麥的抗病育種提供了一定的理論依據(jù)。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，基因工程抗病育種和分子輔助抗病育種正在逐步變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，這些對(duì)加快和促進(jìn)小麥抗病育種、培育小麥優(yōu)良品種具有重要意義[21-22]。多基因聚合育種可以避免單一抗性品種抗性喪失帶來(lái)的危險(xiǎn)，且可以獲得持久抗性，因此，在今后也可以通過(guò)多基因聚合來(lái)克服栽培品種抗性過(guò)快喪失這一難題[23]。

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