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        鴨腸炎病毒和Ⅰ型鴨甲肝病毒熒光PCR快速檢測方法的建立與臨床應(yīng)用

        2018-05-18 03:18:12楊金興王友令張玉霞李莉袁小遠
        畜牧獸醫(yī)科學 2018年6期
        關(guān)鍵詞:檢測方法

        楊金興,王友令,張玉霞,李莉,袁小遠

        (山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所,濟南 250023)

        0 引言

        鴨腸炎病毒(Duck Enteritis virus,DEV)屬于皰疹病毒科皰疹病毒屬,病毒粒子呈球形,直徑為120~180 nm,有囊膜,病毒核酸型為DNA[1-2]。DEV可引起鴨、鵝等水禽的急性敗血性傳染病,發(fā)病率和死亡率都甚高,是危害養(yǎng)鴨業(yè)的最為嚴重的傳染病之一[3]。鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis)的病原有2種:鴨甲肝病毒(Duck Hepatitis A virus,DHAV)和星狀病毒,DHAV分為3個血清亞型,星狀病毒分為2個亞型;其中DHAV的3個血清型相互獨立,無交叉免疫性[4]。

        熒光定量PCR技術(shù)是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針,對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤,可視實時監(jiān)控反應(yīng)過程,快速進行結(jié)果的判定。DEV和DHAV是水禽的2種重要的危害性高的病原,兩者經(jīng)常單獨、或混合感染水禽,因此建立能夠快速準確檢測DEV和DHAV的檢測方法具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        Ⅰ型鴨甲肝病毒的分離毒株QD16和鴨腸炎病毒的分離毒株LY16由山東省農(nóng)科院家禽研究所分離鑒定。

        1.2 方法

        1.2.1 引物(探針)設(shè)計

        根據(jù)GenBank上近年來國內(nèi)DEV、Ⅰ型DHAV流行毒株序列,根據(jù)保守區(qū)域序列,利用Primer ExPress 2.0軟件分別設(shè)計實時熒光定量PCR引物以及TaqMan探針,探針熒光標記物為FAM和MGB。所有引物由華大基因合成,PAGE plus級別純化。

        表1 擴增所用引物和探針引物

        1.2.2 Real-time PCR方法的建立和特異性檢測

        1.2.2.1 Real-time PCR的建立

        鴨甲肝病毒QD16 RNA提取按照博日生物Simple RNA kit操作進行,最后用20 μL DEPC水來溶解RNA,隨后進行反轉(zhuǎn)錄。RT得到的cDNA置于-20℃保存。 鴨腸炎病毒LY16的DNA提取按照TaKaRa DNAiso試劑操作進行,最后用30 μL超純水來溶解DNA。DNA置于-20℃保存。

        在擴增反應(yīng)體系中,對探針濃度、引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化,建立了最佳的熒光定量PCR反應(yīng)體系和擴增程序。最終確定如下的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件:cDNA 5 μL或DNA 1 μL、2×PCR Mix(QIAGEN) 8 μL、Primer F/R各0.2 μL、Probe(50 pM/μL) 0.1 μL、補充水至16 μL。每個樣品做3份平行重復(fù)檢測。最佳反應(yīng)條件:95℃2 min,隨后94℃10 s、59℃10 s、72℃40 s 共進行40 cycles。

        1.2.2.2 特異性檢測

        鴨副黏病毒、不同亞型的禽流感病毒、番鴨細小病毒、II型DHAV進行上述Real-time PCR的檢測,通過擴增曲線,判斷是否出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

        1.2.3 敏感性檢測

        將提取模板分別用分光光度計進行OD值的測定,計算拷貝數(shù)。將模板10倍倍比稀釋,同樣進行上述的熒光PCR檢測,確定最低檢測量,以判定檢測方法的敏感性。

        1.2.4 臨床應(yīng)用

        選取了2015年9月-2017年5月年間44份疑似DHAV和DEV水禽組織樣品和棉拭子進行上述方法的檢測。同時采用病毒分離、常規(guī)PCR、后續(xù)的序列測定等進行驗證。

        2 結(jié)果

        2.1 Real-time PCR擴增

        DEV和DHAV的Real-time PCR擴增均得到良好的擴增曲線(見圖1、2),擴增曲線的Ct值分別為10.5、11.1。3份平行樣品的Ct值基本一致,說明檢測方法的重復(fù)性較好。鴨副黏病毒、禽流感病毒、番鴨細小病毒、II型DHAV均未出現(xiàn)明顯的擴增曲線,說明此方法具有明顯的特異性。

        2.2 敏感性檢測

        將DHAV的RNA模板進行104倍稀釋,此時病毒的拷貝數(shù)為450 copies/μL可以獲得擴增,而DEV病毒的敏感性更好,當拷貝數(shù)為70 copies/μL就可以獲得擴增。

        2.3 臨床應(yīng)用

        圖1 DEV的擴增曲線

        圖2 DHAV的擴增曲線

        2015年9月-2017年5月年間44份疑似DHV和DEV組織樣品進行上述方法的檢測,檢測出了11份DHAV陽性樣品、9份DEV陽性樣品,另外檢測出1份DHAV和DEV混合感染的情況。以上檢測結(jié)果與后期病毒分離、序列分析的結(jié)果完全一致,證明此方法的準確性高、特異性強。

        3 討論

        鴨病毒性腸炎自1957年在我國首發(fā)以來,已廣泛流行于我國華南、華東等養(yǎng)鴨業(yè)較發(fā)達地區(qū)。近年來在北方也有小規(guī)模的流行發(fā)病,造成局部很大的經(jīng)濟損失。鴨甲型肝炎病毒可引起雛鴨的一種傳播迅速和高度致死性傳染病,死亡率很高,可達90%以上;鴨甲型肝炎病毒分為3個血清型,其中I型流行最廣、危害最大[4-5]。國內(nèi)學者也針對以上兩種病原進行了相關(guān)的研究工作:獲得國內(nèi)流行毒株的全基因組序列、針對抗原蛋白的分子特征和功能研究等[6-7]。但是由于這2種病原在近年來出現(xiàn)新的流行特征,本文旨在應(yīng)用針對新流行毒株的FAM探針建立一種快速、特異、準確的鑒別診斷鴨腸炎病毒DEV和I型鴨肝炎病毒DHAV的檢測方法[8]。在擴增反應(yīng)體系中,對探針濃度、引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化,建立了最佳的熒光定量PCR反應(yīng)體系和擴增程序,能夠擴增出高度特異性片段、重復(fù)穩(wěn)定性好。因此,該方法可以及時對臨床樣品進行診斷,從而減少疫病帶來的損失。

        參考文獻

        [1] 程安春, 汪銘書, 劉菲,等. PCR在鴨瘟臨床診斷和免疫及致病機理研究中的初步應(yīng)用[J]. 病毒學報, 2004(4):364-370.

        [2] Mandal P S, Mukhopadhayay S K, Pradhan S, et al.Development of nested polymerase chain reaction-based diagnosis of duck enteritis virus and detection of DNA polymerase gene from non-descriptive duck breeds of West Bengal, India[J]. Veterinary World, 2017, 10(3):336-341.

        [3] Dhama K, Kumar N, Saminathan M, et al. Duck virus enteritis (duck plague) - a comprehensive update[J]. The Veterinary quarterly, 2017, 37(1):57-80.

        [4] Liu G, Wang F, Zheng N, et al. Genetic diversity of the VP1 gene of duck hepatitis virus type I (DHV-I)isolates from southeast China is related to isolate attenuation[J]. Virus Research, 2008, 137(1):137-141.

        [5] Xu Q, Zhang R, Chen L, et al. Complete Genome Sequence of a Duck Hepatitis A Virus Type 3 Identified in Eastern China[J].Journal of Virology, 2012, 86(24):13848.

        [6] Li J, Bi Y, Chen C, et al. Genetic characterization of Duck Hepatitis A Viruses isolated in China[J]. Virus Research,2013, 178(2):211-216.

        [7] Zhang D, Lai M, Cheng A, et al. Molecular characterization of the duck enteritis virus US10 protein[J]. Virology Journal, 2017, 14(1):183-192.

        [8] 孫曉軍,王曉藝,韓宏宇,等.鴨甲肝病毒與新型呼腸孤病毒復(fù)合RT-PCR檢測方法的建立[J].中國動物傳染病學報,2015,23(3):50-54.

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