朱潔倩，魏 蜜，張 偉，劉 月，傅本重，李國元

（1.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院／特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北孝感432000；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430062）

白睡蓮（Nymphaea alba）為多年生水生草本，是一類具有很高觀賞價(jià)值的園林花卉。原產(chǎn)埃及尼羅河，國內(nèi)各省區(qū)均有栽培［1］。它不僅是水景園中必備的浮葉性水生花卉，也是優(yōu)良的新型切花，且根狀莖既可食用或釀酒又可入藥，能治小兒慢驚風(fēng)，全草也可以作綠肥［2］。

白睡蓮病害主要包括睡蓮腐爛病、黑根病、褐紋病、葉腐病、斑腐病和炭疽病等［3－4］。2015年8—10月，筆者在湖北省孝感市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)園發(fā)現(xiàn)白睡蓮黑斑病發(fā)病率達(dá)80%，從黑斑病病葉上分離獲得1株真菌SL－1512，對其完成致病性測定，依據(jù)病原菌形態(tài)特征結(jié)合rDNA－ITS序列分析，將其鑒定為草莖點(diǎn)霉菌（Phoma herbarum）；為明確該病原菌的生物學(xué)特性和最佳的室內(nèi)抑菌藥劑，對不同條件下病原菌菌絲的生長情況展開分析和室內(nèi)藥劑平板篩選，以確定該菌株的生物學(xué)特性，為進(jìn)一步的田間防效試驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患黑斑病的白睡蓮葉片采自湖北省孝感市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地。

本試驗(yàn)選取以下6種培養(yǎng)基作為供試培養(yǎng)基：馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、查氏培養(yǎng)基（CA）、清水洋菜培養(yǎng)基（WA）、燕麥培養(yǎng)基（OA）和玉米粉培養(yǎng)基（CMM），其配制方法參照《植病研究方法》［5］。

篩選和分離白睡蓮黑斑病病菌采用PSA培養(yǎng)基，藥劑篩選試驗(yàn)用的3種生產(chǎn)上常用農(nóng)藥詳細(xì)情況見表1［6－7］。

蛋白胨、酵母粉、NaCl、瓊脂等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

表1 供試藥劑及試驗(yàn)濃度

1.2 白睡蓮黑斑病病菌的生物學(xué)特性研究

參照傅本重等報(bào)道的生物學(xué)特性研究方法［8］，共選取以下8個(gè)指標(biāo)對該致病菌進(jìn)行生物學(xué)特性分析，包括最佳培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、pH值、致死溫度、最佳光照和通氣條件，每個(gè)處理5皿，試驗(yàn)重復(fù)2次。

各指標(biāo)研究中，接種方法均是沿PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的病原菌菌落邊緣打取菌齡一致的菌餅（直徑6 mm）置于培養(yǎng)基平面中間，置于28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3 室內(nèi)藥劑平板篩選

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入一定量的藥劑至凝固前的PSA培養(yǎng)基中混合均勻倒入培養(yǎng)皿中，配成相應(yīng)濃度的含殺菌劑的平板，以不加殺菌劑的PSA為對照，每個(gè)濃度重復(fù)5皿，試驗(yàn)重復(fù)3次。接種觀察和分析方法同“1.2”節(jié)。根據(jù)測得的菌落直徑，利用數(shù)據(jù)分析軟件，計(jì)算出各濃度下的相對抑菌率［9］，取濃度對數(shù)值為x，相對抑菌率幾率值為y［10］，作出毒力回歸方程［11］，并計(jì)算4種供試藥劑對病原菌的有效中濃度（EC50）。

菌落凈直徑＝菌落直徑－菌餅直徑（6 mm）；

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用數(shù)據(jù)處理軟件Excel 2010、SPSS 22和Origin 8對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出毒力回歸方程、決定系數(shù)，然后根據(jù)毒力回歸方程計(jì)算有效中濃度（EC50），作圖、進(jìn)行顯著性差異分析（α＝0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莖點(diǎn)霉菌最佳培養(yǎng)基配方篩選

草莖點(diǎn)霉菌在不同培養(yǎng)基上菌落的生長情況如表2所示。結(jié)果表明，該草莖點(diǎn)霉菌在供試的6種培養(yǎng)基上均能生長，但生長速率及菌絲密集程度存在明顯差異。無論是從生長速率，還是菌絲密集程度來看，PDA和PSA均有利于該草莖點(diǎn)霉菌的生長，生長速率分別達(dá)9.61、9.53 mm／d；其次有利于病原菌生長的是OA，生長速率為7.60 mm／d；而在WA上生長速率最為緩慢，其直徑雖然達(dá)到30.1 mm，但是菌絲很稀疏，僅有很薄的1層。

表2 草莖點(diǎn)霉菌絲在不同培養(yǎng)基上的生長情況

2.2 草莖點(diǎn)霉菌最佳碳源篩選

草莖點(diǎn)霉菌在不同碳源培養(yǎng)基上菌落生長情況如表3所示，試驗(yàn)結(jié)果表明，多種不同的碳源都能被草莖點(diǎn)霉菌利用，但不同碳源對草莖點(diǎn)霉病原菌的生長影響較大。當(dāng)葡萄糖作為碳源時(shí)草莖點(diǎn)霉菌生長速率最快，這可能與速效碳源更容易利用有關(guān)；其次是淀粉、蔗糖和果糖，而在無碳源條件下生長最緩慢且菌絲最稀疏，僅有很薄的1層。

表3 草莖點(diǎn)霉菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的生長狀況

2.3 草莖點(diǎn)霉菌最佳氮源篩選

草莖點(diǎn)霉菌在不同氮源培養(yǎng)基上菌落生長情況如表4所示，草莖點(diǎn)霉菌絲在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌落最大且生長速率最快，在以硝酸鈉和尿素為氮源的條件下次之，在硝酸銨和無氮源條件下較差，說明這幾種氮源里蛋白胨為最優(yōu)氮源。這一結(jié)果與西藏青稞病害病原菌的最優(yōu)氮源［12］類似，但與吉祥草葉斑病病菌細(xì)極鏈格孢的最優(yōu)氮源結(jié)果［13］不一致，這說明不同真菌的最佳氮源存在較大差異。

表4 草莖點(diǎn)霉菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上的生長狀況

2.4 草莖點(diǎn)霉菌最佳溫度篩選

溫度對草莖點(diǎn)霉菌生長的影響如圖1所示。結(jié)果表明，28℃為草莖點(diǎn)霉菌的最適生長溫度，此時(shí)菌落直徑最大，生長狀況最佳，且該病原菌在試驗(yàn)溫度5～28℃范圍內(nèi)均可生長。在5℃條件下，生長速率非常緩慢，而在37、42℃條件下均不能生長。該結(jié)果與張麗等的研究結(jié)果［14］一致，高溫不利于草莖點(diǎn)霉菌生長。

2.5 草莖點(diǎn)霉菌最佳pH值篩選

在pH值為4～10條件下，草莖點(diǎn)霉菌的外觀形態(tài)各指標(biāo)均無明顯區(qū)別，無論是菌絲生長速率，還是菌落的顏色、稀疏程度，均沒有明顯差異，表明草莖點(diǎn)霉耐受pH值范圍廣。由圖2可知，pH值6.0為最適pH值，此時(shí)菌落直徑最大，生長速率達(dá)到9.96 mm／d，其次是pH值為5.0和 pH值為7.0的條件，而在pH值為10.0下生長稍慢，生長速率為8.41 mm／d。

2.6 草莖點(diǎn)霉菌致死溫度研究

結(jié)果表明，草莖點(diǎn)霉在經(jīng)40、45、50℃水浴處理后，菌絲仍然能生長，但是生長緩慢，而在55℃水浴處理后，菌絲不能生長。由此可見，草莖點(diǎn)霉菌致死溫度為55℃，該草莖點(diǎn)霉不能耐高溫。

2.7 草莖點(diǎn)霉菌的最佳光照和通氣條件

試驗(yàn)結(jié)果表明，光暗變化對草莖點(diǎn)霉菌生長的影響不顯著。在光照為0、8、12、16、24 h條件下草莖點(diǎn)霉菌菌絲生長均良好，其中生長速率最大的是在8 h—16 h（光—暗）條件下，達(dá)10.74 mm／d。通氣與不通氣條件下菌絲生長速率差異不顯著，分別為 9.11、8.87 mm／d。

2.8 不同藥劑對病原菌的抑菌效果

以不加殺菌劑的PSA為對照，選用3種常見殺菌劑對草莖點(diǎn)霉菌進(jìn)行室內(nèi)抑菌率測定，試驗(yàn)結(jié)果（表5）表明，3種殺菌劑對草莖點(diǎn)霉菌的生長都產(chǎn)生了一定影響。其中80%代森錳鋅效果最好，加了該殺菌劑的平板其菌絲直徑明顯小于對照平板。在推薦濃度（藥劑包裝上推薦的最低使用濃度）1 000 mg／L下及培養(yǎng)基內(nèi)含藥濃度為1 000 mg／L時(shí)，菌絲基本無法生長，其相對抑菌率達(dá)97.1%，在此基礎(chǔ)上再稀釋5倍即降低濃度至200 mg／L后，抑菌率仍然高達(dá)92.5%，EC50為1.2mg／L。其次是47%春雷·王銅，在培養(yǎng)基內(nèi)含47%春雷·王銅1 000 mg／L時(shí)，相對抑菌率達(dá)到61.5%，但是當(dāng)濃度降至200 mg／L后，其抑菌率大幅度降低，僅為2.6%，EC50為811.4 mg／L。3種供試藥物中80%烯酰嗎啉對病原菌抑菌效果最差，同樣在推薦濃度250 mg／L下，相對抑菌率僅為31.5%，在此基礎(chǔ)上再稀釋5倍后，抑菌率降至 22.4%，其EC50達(dá) 1 418.6 mg／L。

表5 不同殺菌劑對病原菌的毒力

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對白睡蓮黑斑病病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，其最適生長培養(yǎng)基為PDA和PSA，碳源和氮源分別以葡萄糖和蛋白胨最有利于病原菌生長，28℃為草莖點(diǎn)霉菌的最適生長溫度，在低于5℃和高于37℃條件下都不利于菌絲生長，與牛曉慶等的研究結(jié)果［15］基本一致。該草莖點(diǎn)霉菌對pH值不敏感，在4～10范圍內(nèi)均能生長，菌絲生長最適pH值為6。

研究表明，草莖點(diǎn)霉能引起鴨跖草葉斑?。?6］、甘草斑點(diǎn)病［17］，還能引起青棗的腐敗變質(zhì)［18］，是一種分布廣泛的植物病原真菌，并且具有降解植物的特性，同時(shí)也能利用其自身植物毒素，開發(fā)生物源除草劑發(fā)揮除草作用。為了降低化學(xué)除草劑對環(huán)境的污染問題，可以將草莖點(diǎn)霉菌與低劑量的化學(xué)除草劑復(fù)配使用，這樣化學(xué)除草劑也能彌補(bǔ)除草真菌的不足，使之更高效［19］。

室內(nèi)防治藥劑篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，在推薦使用質(zhì)量濃度下，80%代森錳鋅對病原菌菌絲生長的抑制效果最好，相對抑菌率達(dá)97.1%，以80%烯酰嗎啉對病原菌的抑制效果最差，相對抑菌率僅為31.5%。陳旭玉等對廣藿香棒孢霉葉斑病病原菌藥劑篩選結(jié)果同樣表明80%代森錳鋅抑菌效果最好［20］，但是在傅本重等對吉祥草葉斑病菌室內(nèi)防治藥劑篩選試驗(yàn)中表明80%代森錳鋅抑菌效果較差［13］。這些研究表明，同一藥劑對不同病原菌的抑制效果差異較大，在室內(nèi)或?qū)嶋H應(yīng)用中應(yīng)針對不同的病原菌種類，施用不同濃度的不同藥劑。室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果是依據(jù)離體條件下殺菌劑對睡蓮黑斑病病原菌的抑菌效果分析得到的，其田間應(yīng)用效果還不確定，因此，研究結(jié)果具有一定的局限性，可借鑒本研究結(jié)論進(jìn)一步進(jìn)行田間防效試驗(yàn)及評價(jià)。

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