江 羚，曾 昆，2，邵 杰，杜道林，2

（1.江蘇大學環(huán)境與安全工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學環(huán)境生態(tài)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

四環(huán)素類抗生素是由放線菌產生的一類廣譜性抗生素，以十二氫化并四苯基結構為基本母核，包括四環(huán)素（tetracycline，TC）、土霉素（oxytetracycline，OTC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）及半合成衍生物多西環(huán)素（doxycycline，DC）等，結構式如圖1所示。四環(huán)素類抗生素對大多數(shù)革蘭氏陽性和陰性菌均表現(xiàn)出抑制活性，如葡萄球菌、芽孢桿菌、肺炎桿菌、溶血性鏈球菌、立克次氏體及沙眼病毒等。有關研究表明，四環(huán)素類抗生素在低劑量添加時有促進動物生長和提高飼料利用率的作用，高劑量使用時可用來治療疾病。此外，為了產品的保鮮，在肉制品加工過程中也會添加一定的抗生素類藥物來抑制細菌的滋生。據(jù)不完全統(tǒng)計，歐盟國家每年消耗的抗生素總量約5 000 t，其中四環(huán)素類抗生素就高達2 300 t［1］；在美國，四環(huán)素類抗生素約占整個抗生素市場份額的15.8%［2］；我國是四環(huán)素類抗生素生產、銷售和使用大國，2014年僅四環(huán)素衍生物及其鹽出口量就高達1.55×107kg。

四環(huán)素類抗生素的大量使用，使其廣泛殘留在動物源性食品、環(huán)境水樣以及土壤中。在一些常見的動物性食品，如雞肉［3］、豬肉［4］、牛奶［5］和蜂蜜［6］等中都檢測出有不同程度的四環(huán)素類藥物殘留。在美國愛荷華州［2］、韓國的漢江［7］以及中國的黃浦江［8］等均檢測出四環(huán)素類抗生素，含量高達0.2 g／L。環(huán)境中的抗生素殘留除了造成化學污染外，還可能會誘導抗性基因和抗性微生物的產生。這些抗性微生物可以通過直接或間接接觸的方式進入人體，使人體的耐藥性增強，從而給人類公共健康帶來重大威脅。歐盟制定了四環(huán)素類抗生素最大殘留限量標準（maximum residue limit，MRL），其中CTC和4－差向金霉素、DC、OTC、TC在奶和肌肉中為100μg／kg，肝臟中為300μg／kg，腎臟中為600μg／kg；我國動物性食品中獸藥最高殘留限量（農業(yè)部235號公告）規(guī)定CTC、DC、OTC和TC在肌肉、肝臟以及腎臟中的殘留限量分別為100、300、600μg／kg，DC、OTC和 TC在奶中的殘留限量為100μg／L。

鑒于四環(huán)素類抗生素在水體、土壤、動物性食品中的廣泛殘留，會對人體和環(huán)境造成巨大的危害，發(fā)展簡便、快速、靈敏的檢測方法顯得尤為必要。四環(huán)素類抗生素的檢測方法主要有微生物法［9－11］、ELISA方法［8，12－14］、HPLC［15－17］以及 LCMS［18－20］方法。微生物法能夠同時篩查大量樣本，但是靈敏度低、耗時長；HPLC／LC－MS具有靈敏度高、準確性好等優(yōu)點，但是有需要昂貴的設備和專業(yè)操作人員、前處理過程復雜等不足，限制了其在快速檢測領域的應用。以抗原抗體特異性結合為基礎的ELISA方法在快速檢測領域中占據(jù)主導地位。近年來，在傳統(tǒng)的ELISA方法基礎上，發(fā)展出了多種快速分析方法。比如，用適配體取代抗體，建立了酶聯(lián)核酸適配體分析（enzyme linked aptamer assay，ELAA），引入了熒光、納米顆粒等信號報告分子，傳感器方法提高了檢測的靈敏度，縮短了檢測時間。本文主要綜述了四環(huán)素類抗生素特異性識別元件以及各種快速分析方法在四環(huán)素類抗生素檢測中的應用，旨在對該領域的發(fā)展趨勢和方向提供參考。

1 特異性生物識別元件

自20世紀50年代抗體應用于快速檢測領域以來，因其特異性、靈敏度以及親和力等優(yōu)勢，被廣泛應用于醫(yī)學、農業(yè)、食品安全以及環(huán)境污染物等的快速檢測中。然而，抗體制備過程周期較長（3～6個月），需要大量的試驗動物，并且針對小分子物質的抗體制備較為困難。隨著分子生物學技術以及材料科學的發(fā)展，一些與抗體具有類似功能的新型識別元件，比如重組抗體、核酸適配體、分子印跡聚合物等，被表達或合成出來，并廣泛應用到快速檢測領域中。

1.1 抗體

以抗原與抗體特異性結合特性為基礎的免疫分析方法，在快速檢測領域中占據(jù)著核心地位。抗體自身的特性直接影響檢測方法的特異性、靈敏度、準確性和精密度。四環(huán)素類抗生素屬于半抗原（分子量小于1 000），不具有免疫原性，須與大分子物質（蛋白質、多聚物等）偶聯(lián)后才能刺激機體產生抗體。半抗原和大分子蛋白偶聯(lián)方法的設計是抗體制備過程中的關鍵步驟，直接決定了所得抗體的特異性。四環(huán)素類抗生素以十二氫化并四苯基結構為母核，側鏈取代基各有不同（圖1）。在偶聯(lián)時盡可能暴露母核結構，獲得的抗體能夠識別一類具有共同結構的化合物，即廣譜性抗體；在蛋白質表面暴露靶物質的獨特結構，獲得的抗體對一種物質有較強的識別能力，即特異性抗體。由于歐盟和我國的殘留限量均規(guī)定了CTC、DC、OTC、TC的MRL，在針對四環(huán)素類抗生素的檢測中，單一物質以及多殘留分析都是分析學家的熱門研究方向。

1.1.1 特異性抗體 為了獲得特異性抗體，樂濤以2號碳原子上的—CONH2和7號、9號碳原子位點上的—OH作為特征性基團，采用對氨基苯甲酸（4－aminobenzoic acid，PABA）為間隔臂，合成免疫原DC－PABA－BSA，獲得抗DC多克隆抗體，對DC的半數(shù)抑制濃度（50%concentration of inhibition，IC50）為10.65 ng／mL，與 TC、CTC、OTC的交叉反應率分別為2.34%、2.46%、5.07%［21］。同時，Le等還利用雜交瘤技術篩選出1株能夠特異性識別DC的單克隆抗體2.3／3A6，IC50達到2.36 ng／mL，與4－epi－DC的交叉反應率為 58.4%，與其他四環(huán)素類抗生素及其差向異構體無交叉反應［22］。李嘉嘉選用碳二亞胺法合成了OTC人工抗原并免疫動物，制備抗OTC單克隆抗體，對 OTC的 IC50為 0.217 mg／mL，對 TC和CTC的交叉反應率分別為 13.35%、11.84%［23］。Adrian等利用甲烯土霉素9號碳原子上的烯烴與3－巰基丙酸相連，合成免疫原TC1并成功地制得了能夠特異性識別多西環(huán)素的多克隆抗體，IC50為 1.26 ng／mL［24］。李靚以金霉素 2號碳原子上的—CONH2為活性基團，采用EDC法合成免疫原，通過雜交瘤技術成功篩選到3株高效價、高特異性識別鹽酸金霉素細胞株，其中6H5－H4的親和常數(shù) Ka為4.05×1010L／mol，對金霉素的IC50為29.86 ng／mL，與同系物四環(huán)素交叉反應率為 1.48%［25］。

1.1.2 廣譜性抗體 Zhang等分別采用 Tolidine法、ABA法以及CDI法合成3種完全抗原免疫動物，所獲得的血清均能與3種不同的免疫原相互識別，采用同源性ELISA時TC的抑制效果較差，而異源性方法則有明顯的抑制效果，其中以TC－CDI－cBSA為免疫原的兔血清與TC－ABA－cOVA包被原配對時可以獲得較好的抑制效果［26］。Pastornavarro等采用2種策略合成半抗原：在CTC／TC／OTC結構上衍生出羧基基團，采用EDC法與載體蛋白偶聯(lián)；通過Mannich反應直接連接CTC／TC／OTC與蛋白。不同的抗原與抗體配對發(fā)現(xiàn)，以KLH－OTC－3－Ⅲ作免疫原，OVA－TC－1為包被抗原，建立的ELISA方法靈敏度最高。并且該抗體能夠識別四環(huán)素類藥物，對RTC、OTC、MC、CTC的交叉反應率分別為91%、30%、14%、10%［27］。高峰合成了 2類完全抗原：DC／CTC上引入對氨基苯乙酸后通過混合酸酐法與蛋白偶聯(lián)以及DC直接與載體蛋白偶聯(lián)，采用2種免疫原免疫小鼠，最終獲得2株DC廣譜單克隆抗體R3M1（免疫原為DC－BSA）和R8M4（免疫原為DC－C－BSA）［28］。以CTC－C－OA為包被原，R8M4可以識別 7種四環(huán)素類藥物，對 DC、TC、OTC、CTC、MNC、MTC以及 DMC的交叉反應率分別為100%、68%、93%、65%、47%、102%、49%，IC50在 1.5～6.9 ng／mL之間［28］。

1.2 核酸適配體

雖然抗原－抗體結合的特異性強、靈敏度高，但是也存在著一些缺點：需要大量的試驗動物、免疫周期長和不易獲得較理想的抗體等。與抗體相比，核酸適配體不僅選擇性專一而且具有體外合成周期短、性質穩(wěn)定、易于修飾和保存、靶標分子種類多、無免疫原性和毒性等優(yōu)勢，并且可以對適配體的3′和 5′端進行修飾，而不影響目標物的結合位點［29－31］，比如生物素［32］、巰基［33］和一些標記分子［34］。目前，基于核酸適配體的生物傳感器分析方法已被廣泛應用到檢測各種蛋白質、小分子化學物質、代謝物和環(huán)境污染物中［35－41］。

Niazi等采用SELEX技術，篩選到7個能夠特異性識別四環(huán)素骨架結構的 DNA適配體（T7、T15、T19、T20、T22、T23、T24），其解離常數(shù)Kd在63～483 nmol／L之間。這7種適配體均能同時識別TC、OTC和DC，除T20對TC的親和力最高外，其他6種適配體對OTC的親和力最高［42］。Kim等利用OTC－BSA混合物通過SELEX技術，篩選得到識別OTC的適體（aptamer）4株，分別為 OTC3、OTC6、OTC9和 OTC16。其中OTC3對OTC顯示出最強的結合能力，其解離常數(shù) Kd為4.7 nmol／L［43］。Chen等通過等溫滴定量熱技術篩選到特異性識別四環(huán)素的適配體，Kd為 5.18×10－5mol／L［44］。

1.3 分子印跡

分子印跡技術是模擬抗原抗體反應，以目標物為模板，通過化學方法合成一種高分子聚合物——分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP），該聚合物能夠特異性地與目標物質結合達到檢測的目的［45－46］。與傳統(tǒng)抗體相比，分子印跡聚合物具有穩(wěn)定性好、易制備、周期短、價格低廉、易于保存且能在復雜的環(huán)境中得以應用等優(yōu)點［47］。

Li等以 OTC為模板，鄰苯二胺（o－phenylenediamine，OPD）為功能單體，合成MIP，對四環(huán)素類化合物的識別能力為OTC＞TC＞CTC［48］。楊春艷等以TC為模板，甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）為功能單體，合成 MIP，以 50 mg MIP制備的固相萃取柱對 CTC的動態(tài)吸附量為 2.6×10－4g／g［49］。Lian等以 CTC為模板，殼聚糖衍生物（chitosan derivative，CSDT）為單體，合成MIP，對 CTC有較好的識別能力，對四環(huán)素類其他化合物識別能力較弱，具有較好的特異性［50］。Chen等以 OTC為模板，MAA為功能單體，并結合Fe3O4合成了具有磁性的四環(huán)素分子印跡聚合物。經鑒定，這種磁性MIPs能夠選擇性地識別四環(huán)素類化合物，其平均解離常數(shù) Kd為 724μmol／L［51］。

2 分析方法

隨著生物檢測技術的發(fā)展，放射性同位素、酶、量子點、熒光素等報告分子被引入到分析方法中，使得快速分析方法的性能得到了極大的改善。但是報告分子與抗體的偶聯(lián)過程，可能會導致抗體活性下降或干擾抗原與抗體結合，因此近年來越來越多的學者試圖探索出更具性價比的無標記的檢測方法，其中以傳感器技術應用最為廣泛。

2.1 ELISA／ELAA方法

ELISA方法是最常見的快速檢測方法，許多研究者都建立了 ELISA方法用于 TC、DC、OTC以及 CTC的檢測［21，24，26－27，52］，檢測限最低可達 0.19μg／L［53］，均可滿足歐盟殘留限量的檢測標準。而Jeon等在ELISA方法中引入了生物素－親和素系統(tǒng)，用于檢測牛奶中的四環(huán)素殘留，其方法的LOD為1.0×10－10mol／L，線性范圍在 3.16×10－10～3.16×10－7mol／L［54］。

除ELISA法外，以適配體為識別分子代替抗體建立的ELAA在四環(huán)素快速檢測中也有報道。Wang等建立了基于適配體的間接競爭ELISA方法特異性檢測蜂蜜中的四環(huán)素含量，該方法的最低檢測限為9.6×10－3ng／mL，線性范圍為0.01～100.00 ng／mL［55］。王賽等隨后又建立了基于適配體的直接競爭ELISA方法，在蜂蜜中四環(huán)素的最低檢測限為0.097 8 ng／mL，線性范圍可 達 0.1～1 000.0 ng／mL［56］。Jeong等應用特異性識別四環(huán)素的ssDNA和RNA適配體建立了競爭酶聯(lián)免疫適配體方法檢測牛奶中的四環(huán)素殘留，其LOD為 2.10×10－8mol／L［57］。張璇等通過 Mannich法偶聯(lián)HRP和四環(huán)素分子制備酶標記物，建立了四環(huán)素酶連適配體檢測方法，該法的 IC50為 0.705 g／mL，LOD為 2.5 ng／mL［58］。

2.2 熒光分析方法

相對于ELISA法，熒光分析法具有更高的靈敏度，對某些物質的微量分析能夠達到10－10g數(shù)量級。近年來隨著材料科學的發(fā)展，量子點（quantum dots，QDs）在分析化學等領域已成為重要的生物熒光探針。與傳統(tǒng)熒光染料相比，QDs具有自身特有的光學穩(wěn)定性、良好的生物相容性和長熒光壽命特性等特點，基于其開發(fā)的量子點熒光分析法也成為快速檢測技術之一。García－Fernandez等用 CdSe／ZnS標記OTC－BSA，建立了直接篩選牛肉中4種四環(huán)素的免疫分析方法，檢測限為 0.12μg／L，線性范圍為 0.26～3.53μg／L［59］。王云云采用EDC／NHS為活化劑，偶聯(lián)量子點和TC抗體，構建直接競爭熒光免疫分析方法，在酶標板上通過陣列分析實現(xiàn)對牛奶中四環(huán)素的殘留檢測，檢測限達到0.005 ng／mL，線性范圍為 0.01～10.00 ng／mL［60］。Hou等利用簡單的微波輔助方法在碳量子點表面合成了能夠和四環(huán)素分子特異性結合的分子印跡聚合物，建立了基于CDs＠MIPs的熒光檢測牛奶中四環(huán)素殘留的新方法，檢測限為 5.48 nmol／L［61］。

2.3 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器是近些年來發(fā)展起來的一種新型檢測分析方法，其原理是靶物質與電極上的生物識別元件（抗體、核酸適配體、MIP、細胞等）相結合，導致生物識別元件分子變構或活性發(fā)生改變，以電流、電勢或電容為特征檢測信號。電化學生物傳感器具有上樣體積小、響應快、準確度高、無需標記、可以實現(xiàn)連續(xù)在線檢測等顯著優(yōu)勢，在醫(yī)學、食品工業(yè)和環(huán)境污染物檢測等領域展示了十分廣闊的應用前景。

2.3.1 以抗體為識別元件的電化學生物傳感器 Conzuelo等將抗TC抗體組裝在修飾有蛋白G的磁珠上，HRP標記的TC和溶解在PBS里的TC標準品或樣品競爭性地與TC抗體結合［62］。通過磁性裝置分離并洗滌后，磁珠被移到絲網印刷碳電極上檢測電信號。以此建立1種可棄式的傳感器，用于牛奶中四環(huán)素類殘留檢測，對TC、CTC、OTC以及DC的檢測限分別為 8.9、66.8、1.2、0.7 ng／mL［62］。

2.3.2 以適配體為識別元件的電化學生物傳感器 Kim等將巰基修飾的OTC適配體固化在金叉指陣列電極芯片上，利用循環(huán)伏安法和方波伏安法監(jiān)測電信號，構建1種特異性識別OTC的生物傳感器，線性范圍在1～100 nmol／L之間［63］。Zhou等在玻碳電極表面組裝了1層多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs），通過多壁碳納米管上的羧基與TC適配體偶聯(lián)，構建1種新型的電化學傳感器，采用循環(huán)伏安法檢測電信號，實現(xiàn)對TC的快速檢測。優(yōu)化條件后，對TC的檢測限為 5×10－9mol／L，線性范圍在 1×10－8～5×10－5mol／L之間［64］。吳艷等將 TC核酸適配體共價固定于玻碳電極表面構建出可快速現(xiàn)場檢測牛奶中四環(huán)素的新型生物傳感器，檢測限為1μg／L，線性檢測范圍為1～100μg／L［65］。Hou等將適配體組裝在懸臂上，建立懸臂梁陣列傳感器方法，快速、特異性檢測OTC殘留，該方法的最低檢測限可達 0.2 nmol／L［66］。Liu等在玻璃電極表面組裝了石墨相氮化碳（g－C3N4）和CdS量子點復合物，并結合TC適配體，構建了能夠特異性識別四環(huán)素的光電化學傳感器，該傳感器成功地結合了g－C3N4和CdS量子點的特性于一體，其檢測范圍在 10～250 nmol／L，檢測限為 5.3 nmol／L［67］。

2.3.3 以MIP為識別元件的電化學生物傳感器 Li等采用OTC和HRP－OTC競爭性與MIP結合的策略，建立了基于分子印跡的電化學傳感器用于OTC的檢測，最低檢測限為6.49×10－10mol／L，線性范圍為 0～1×10－7mol／L［48］。Lian等在金電極上依次組裝β環(huán)糊精－多壁碳納米管復合物、納米金－聚酰胺胺樹狀分子復合物以及MIP，構建電化學分子印跡傳感器用于檢測牛奶和蜂蜜中的OTC，其最低檢測限為4.958×10－8mol／L，線 性 范 圍 為 9 ×10－8～5 ×10－5mol／L［50］。廉文靜利用最優(yōu)化層數(shù)的殼聚糖－多壁碳納米管復合物多層膜和金納米粒子構建1種靈敏測定土霉素的分子印跡電化學傳感器方法。該方法最低檢測限為2.7×10－8mol／L，線性范圍為 3.0×10－8～8.0×10－5mol／L［68］。

2.3.4 其他傳感器 還有一些傳感器，雖然沒有應用抗體、適配體和MIP作為生物識別元件，而是利用其他生物活性物質，但建立的方法檢測限低、靈敏度高、特異性強，用來檢測目標物非常簡單、方便。Ghodsi等利用OTC結構中的苯酚基團在H2O2存在的條件下能夠被HRP氧化的特性，并結合多壁碳納米管（MWCNTs）獨特的催化特性，建立了一種簡單、靈敏的電化學傳感器方法檢測OTC，優(yōu)化條件后，該方法的檢測限達 35 nmol／L，線性范圍在 15.0μmol／L～1.5 mmol／L［69］。

2.4 基于金顆粒的檢測方法

納米金顆粒標記抗體結合硝酸纖維素膜建立的測流層析試紙條，具有檢測快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點，是快速檢測領域，尤其是現(xiàn)場檢測的重要組成部分。劉麗等用實驗室自制的金標記抗四環(huán)素單抗，建立了金標記快速檢測試紙條檢測食品中四環(huán)素的殘留方法，靈敏度可達50 ng／mL［70］。武玉香利用固相抗原與游離CTC競爭性結合膠體金標記CTC抗體的原理，Luo等建立了膠體金免疫層析條法以及斑點金免疫滲濾方法，實現(xiàn)了對食品中CTC的快速檢測。2種方法的檢測限分別為 0.7、0.4μg／mL［71］。檀尊社等建立了膠體金免疫層析法用于快速檢測水產品中四環(huán)素類藥物殘留，該方法檢測水產品樣品時，對 TC、CTC、OTC、DC的檢測限分別為100、200、400、100 ng／mL，檢測過程僅需 5～10 min［72］。

除測流層析試紙條外，一些新型的分析方法是基于納米金顆粒的理化性質建立的。Luo等將特異性識別TC的適配體包被在納米金顆粒表面，制得具有催化能力的納米顆粒（aptamer coated nanogold，ACNG），ACNG能夠催化 Fehling反應，在60℃時產生 Cu2O晶體［73］。當沒有 TC時，穩(wěn)定的ACNG能夠催化產生較多的Cu2O晶體，具有較高的共振散色值（resonance scattering，RS）；當有 TC存在時，TC與特異性適配體結合，使納米金顆粒暴露并沉聚，不能催化產生Cu2O晶體，RS值降低?；谏鲜鲈恚琇uo等建立了一種檢測牛奶中四環(huán)素含量的共振散射光譜法，該方法的檢測限為11.6 nmol／L，樣本添加回收率為105%～109%［73］。Luo等建立了一種四環(huán)素比色分析方法，用于牛奶中四環(huán)素殘留的檢測［74］。當沒有TC時，納米金顆粒與適配體因靜電引力而沉聚；當有TC存在時，TC特異性地與其適配體結合，誘導適配體構象變化，使得納米金顆粒釋放出來，引發(fā)吸光度的改變。該方法的最低檢測限為 0.039μg／mL，線性范圍為 0.2～2.0μg／mL［74］。

2.5 其他

除了以上所列出的比較具有代表性的快速分析方法外，還有一些其他的分析方法，雖然應用不廣，但對分析方法的改進和發(fā)展來說仍然具有重要意義。Weber等成功地建立了一種基于原核細胞和哺乳動物細胞的生物傳感器的體外檢測方法，該方法引用了ELISA模式，檢測四環(huán)素類抗體的最低檢測限能夠達到ng／mL級別［75］。楊春艷等利用CTC在酸性介質中能極大地增敏Ce（Ⅳ）和Rh6G的化學發(fā)光特性，建立了分子印跡固相萃?。瘜W發(fā)光測定鹽酸金霉素的方法，線性范圍為2×10－8～1×10－6g／mL，檢測限為 4×10－9g／mL［49］。

3 結語

由于四環(huán)素類抗生素的廣泛使用，在水體、土壤、動物性食品中都會有抗生素殘留。雖然食品和環(huán)境中的抗生素殘留并不表現(xiàn)出急性毒性作用，但長期攝入和接觸可能會產生各種慢性和蓄積性毒性［76］，還可能引起耐藥菌株的增加，進而通過環(huán)境和食物鏈間接危害到人類的身體健康和安全。因此，各國也加大了對抗生素非法使用和濫用情況的監(jiān)管力度。

表1中匯總了現(xiàn)有的四環(huán)素快速分析方法，發(fā)現(xiàn)其具有以下特點：（1）盡管特異性抗體仍然是重要的生物識別元件，但是新興的識別分子，如核酸適配體、MIP等，已經成功地應用于快速分析方法的建立；（2）電化學傳感器方法因其靈敏度高、快速等優(yōu)勢在四環(huán)素快速分析中得到長足發(fā)展，并且與新型的納米材料相結合，提高了檢測方法的性能；（3）充分利用核酸的理化性質，結合適當?shù)募{米材料（納米金等），建立一系列新型的分析方法，可以實現(xiàn)定量／半定量的檢測。在未來的檢測領域中，結合抗體、適配體、MIP等識別元件的特性，聯(lián)合各種新材料（碳納米管、金屬納米顆粒等）或新技術（傳感器技術），開發(fā)出新穎的檢測方法，依然是四環(huán)素類抗生素快速分析的發(fā)展方向。

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［10］劉興泉，馮 震，姚 蕾，等.采用高通量微生物法檢測四種抗生素在雞蛋中的殘留［J］.現(xiàn)代食品科學，2011，27（4）：465－467.

［11］劉興泉，馮 震，姚 蕾，等.采用高通量微生物法和HPLC法檢測豬肉中四環(huán)素和磺胺類抗生素殘留［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（4）：194－197.

［12］國占寶，武玉香，田文禮，等.食品中四環(huán)素類殘留的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的研制［J］.食品科學，2011，32（2）：333－337.

表1 四環(huán)素快速分析方法

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［15］胡冠九，王 冰，孫 成.高效液相色譜法測定環(huán)境水樣中5種四環(huán)素類抗生素殘留［J］.環(huán)境化學，2007，26（1）：106－107.

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［17］TylováT，Ol sˇovskáJ，Novák P，et al.High－throughput analysis of tetracycline antibiotics and their epimers in liquid hogmanure using Ultra Performance Liquid Chromatography with UV detection［J］.Chemosphere，2009，78（4）：353－359.

［18］高曉丹.分子印跡技術與LC－MS／MS聯(lián)用在食品中痕量四環(huán)素類檢測的應用研究［D］.武漢：華中科技大學，2007.

［19］Pamreddy A，Hidalgo M，Havel J，et al.Determination of antibiotics（tetracyclines and sulfonamides）in biosolids by pressurized liquid extraction and liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2013，1298（13）：68－75.

［20］Spisso B F，Monteiro M A，Lima A M B，et al.A liquid chromatography－tandem mass spectrometry confirmatory assay for the simultaneous determination of several tetracyclines in milk considering keto－enol tautomerism and epimerization phenomena［J］.Analytica Chimica Acta，2009，656（1／2）：72－84.

［21］樂 濤.多西環(huán)素殘留免疫學快速檢測技術研究［D］.武漢：華中農業(yè)大學，2010.

［22］Le T，Zhao W Z，WeiW，et al.Development of a highly sensitive and specific monoclonal antibody－based enzyme－linked immunosorbent assay for determination of doxycycline in chicken muscle，liver and egg［J］.Food Chemistry，2012，134（4）：2442－2446.

［23］李嘉嘉.土霉素單克隆抗體的制備［D］.洛陽：河南科技大學，2012.

［24］Adrian J，F(xiàn)ernández F，Sánchezbaeza F，et al.Preparation of antibodies and development of an enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）for the determination of doxycycline antibiotic in milk samples［J］.Journal of Agricultural＆Food Chemistry，2012，57（60）：3837－3846.

［25］李 靚.鹽酸金霉素免疫學快速檢測方法研究［D］.洛陽：河南科技大學，2012.

［26］Zhang Y L，Lu SX，Liu W，et al.Preparation of anti－tetracycline antibodies and development of an indirect heterologous competitive enzyme－linked immunosorbent assay to detect residues of tetracycline in milk［J］.Journal of Agricultural＆Food Chemistry，2007，55（2）：211－218.

［27］Pastornavarro N，Morais S，Maquieira A，et al.Synthesis of haptens and development of a sensitive immunoassay for tetracycline residues：application to honey samples.［J］.Analytica Chimica Acta，2007，594（2）：211－218.

［28］高 峰.強力霉素廣譜單克隆抗體的制備及應用［D］.保定：河北農業(yè)大學，2013.

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