黎曉麗 ，賴維 ，劉麗 ，陳劍

（1廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州510623；2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510630；3河南省濮陽市油田總醫(yī)院，河南 濮陽 457001）

頭癬是一類真菌感染頭皮、毛發(fā)的疾病，成人、兒童均可發(fā)病。頭癬傳染性強(qiáng)，呈世界性分布，散發(fā)或流行，可造成永久性脫發(fā)和頭皮瘢痕，破壞美觀，影響患者心理和社交[1]。頭癬按病原菌種類可分為3類：黃癬、白癬、黑點(diǎn)癬。真菌雖然種類繁多，但能致頭癬的真菌較少，如皮膚癬菌中部分毛癬菌和小孢子菌是頭癬主要致病菌；皮膚癬菌中的絮狀表皮癬菌，以及霉菌、念珠菌不易致頭癬[2-3]。目前為止，頭癬確切的發(fā)病機(jī)制及致病過程尚不清楚。

近年由于飼養(yǎng)家庭寵物及經(jīng)濟(jì)動物的增多，以及廣譜抗生素、免疫抑制劑、生物制劑等藥物的運(yùn)用，頭癬發(fā)病率有所回升[4]。既往認(rèn)為真菌致頭癬可能與其形態(tài)轉(zhuǎn)變和宿主免疫有關(guān)[5]，隨著對蛋白酶作為真菌毒力因子之一的研究深入，推測頭癬致病可能與蛋白酶有關(guān)，因此，本研究將真菌分為2組：頭癬致病菌組和非致病菌組，采用體外液體誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，初步了解真菌在體外侵襲毛發(fā)后所致毛發(fā)的改變和所釋放出的總蛋白量，釋放出的蛋白作為蛋白酶分解的產(chǎn)物，與釋放的蛋白酶正相關(guān)，通過對比總蛋白量初步判定各組蛋白酶的活性大小，為闡明頭癬發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 致病菌組：斷發(fā)毛癬菌、許蘭毛癬菌、石膏樣小孢子菌、須癬毛癬菌，紅色毛癬菌。

非致病菌組：短帚霉、絮狀表皮癬菌。

對照組：①只加緩沖液及頭發(fā)，不加真菌；②只加緩沖液及真菌，不加頭發(fā)。毛發(fā)為未焗油的健康兒童頭發(fā)，經(jīng)高壓消毒滅菌。

1.2 誘導(dǎo)緩沖液MgSO4（0.5g/L），K2HPO4（0.46g/L），KH2PO4（1.0 g/L），氯霉素注射液0.1 g/L，pH為7.0。

1.3 受試菌株的培養(yǎng) 將受試菌株在沙堡培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌落成熟，挑取適量菌配成濃度為5×106CFU/mL的菌懸液（產(chǎn)孢多菌-斷發(fā)毛癬菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌、短帚霉只取孢子；產(chǎn)孢少菌-絮狀表皮癬菌、許蘭毛癬菌取菌絲），取5 mL接種于含頭發(fā)0.2 g的液體培養(yǎng)基（每瓶含25 mL緩沖液）,25℃培養(yǎng)20周。

1.4 培養(yǎng)后上清液BCA法檢測所含的總蛋白量

1.4.1 主要試劑盒、儀器 BCA蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)試劑盒，酶標(biāo)儀，光學(xué)顯微鏡。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)主要步驟

1.4.2.1 觀察培養(yǎng)后真菌菌量增長情況，光學(xué)顯微鏡下觀察20周后各組頭發(fā)改變。

1.4.2.2 配制BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液-配制BCA工作液-加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品及待測樣品-酶標(biāo)儀測定OD值-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 兩獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 22.0。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)后真菌生長情況 紅色毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌、石膏樣小孢子菌、須癬毛癬菌：菌絲多，包饒毛發(fā)。絮狀表皮癬菌、短帚霉、許蘭毛癬菌：菌絲少，不包饒毛發(fā)。

2.2 各組毛發(fā)的變化 ①斷發(fā)毛癬菌：大部分毛小皮掀起，毛刷狀。②許蘭毛癬菌：毛發(fā)外觀基本完好，極少毛小皮掀起。③石膏樣小孢子菌：部分毛小皮掀起，毛刷狀，部分有穿孔，部分形態(tài)完全破壞。④須癬毛癬菌：部分毛小皮掀起，毛刷狀，部分有穿孔，部分形態(tài)完全破壞。⑤紅色毛癬菌：部分毛小皮掀起，毛刷狀。⑥短帚霉：少數(shù)毛小皮掀起。⑦絮狀表皮癬菌：少數(shù)毛小皮掀起。

2.3.1 20周后所得蛋白濃度 見表1。

2.3.2 秩和檢驗(yàn)頭癬致病菌組和非致病菌組總蛋白量，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 20周后頭發(fā)變化情況

表1 20周后所得蛋白濃度g/L

圖2 誘導(dǎo)后所得總蛋白量對比圖（單位：g/L）

3 討論

1963年Mercer等[6]發(fā)現(xiàn)感染頭發(fā)的須癬毛癬菌菌絲頂端的穿透器官可分泌出某種物質(zhì)破壞頭發(fā)的二硫鍵，從而逐漸消化頭發(fā)，現(xiàn)這種物質(zhì)被證實(shí)為蛋白酶。蛋白酶是皮膚癬菌致病的重要毒力因子，與其獲得營養(yǎng)、擴(kuò)大侵襲及誘導(dǎo)宿主免疫相關(guān)[7-8]。蛋白酶可分為酸、堿兩類酶，多種真菌均可產(chǎn)生蛋白酶，蛋白酶的產(chǎn)生也需要底物的誘導(dǎo)，角蛋白底物誘導(dǎo)真菌產(chǎn)生蛋白酶會因底物或真菌種類的不同而不同[9]。Okafor等[10]曾對5種皮膚癬菌進(jìn)行釋放蛋白量的測定，結(jié)果顯示所有受試皮膚癬菌均能降解頭發(fā)，以石膏樣小孢子菌最強(qiáng)，奧杜央小孢子菌最弱。Katiyar等[11]對比分離出的12種真菌以頭發(fā)誘導(dǎo)30 d后釋放的蛋白量，發(fā)現(xiàn)皮膚癬菌釋放蛋白量和對頭發(fā)破壞程度均比枝頂孢霉高。本實(shí)驗(yàn)以兒童頭發(fā)為唯一氮源，采用體外液體培養(yǎng)方法對比釋放的總蛋白量，20周后所測得的蛋白是因蛋白酶分解頭發(fā)角蛋白而來，總量與蛋白酶活性成正相關(guān)，通過對比總蛋白量可初步對比真菌蛋白酶的活性，結(jié)果顯示上清液中總蛋白量有差異，表明各種真菌誘導(dǎo)后蛋白酶活性不同，與既往國外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；結(jié)合另外兩個(gè)方面（毛發(fā)改變及真菌菌量變化）對比不同真菌對頭發(fā)的降解力，證實(shí)了相同底物對蛋白酶水解的抵抗力有差異。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第1組中許蘭毛癬菌蛋白量、毛發(fā)改變在所有受試菌中最小，并且該菌不能從毛小皮處穿入頭發(fā)，推測黃癬致病與毛干誘導(dǎo)的蛋白酶無關(guān)，而黃癬患者真菌鏡檢可見到發(fā)內(nèi)及痂內(nèi)均有孢子和菌絲，黃癬菌可能是先經(jīng)皮膚或毛囊處感染，隨著頭發(fā)向外生長，真菌也被帶出毛囊。絮狀表皮癬菌和短帚霉蛋白量均低，毛發(fā)破壞輕，表明其對頭發(fā)的侵襲力差，所以臨床表現(xiàn)為不致頭癬。另外，頭癬致病菌除黃色毛癬菌外，均可將毛干分解為可溶性蛋白，筆者推測蛋白酶與黑點(diǎn)癬、白癬的發(fā)病有關(guān)，這一點(diǎn)尚有待擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步證實(shí)。

總之，通過筆者以上研究發(fā)現(xiàn)，真菌在體外能分解頭發(fā)使其釋放出可溶性蛋白供真菌生長繁殖。各種真菌對頭發(fā)的分解力有差異，頭癬非致病菌對頭發(fā)分解力均差，但并非所有頭癬致病菌都顯示強(qiáng)的頭發(fā)分解能力，比如許蘭黃癬菌，推測真菌蛋白酶可能參與某些類型頭癬致病，但并不是唯一決定因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)，由于角蛋白富含胱氨酸二硫鍵，其水解除了蛋白酶，還需半胱氨酸雙加氧酶及亞硫氨酸鹽流出泵的參與，前者還參與酵母形態(tài)到菌絲形式的過渡，并且是半胱氨酸氧化成半胱氨酸磺酸的關(guān)鍵，對亞硫酸鹽的產(chǎn)生和分泌有重要作用，亞硫酸鹽作為還原劑，可將部分角蛋白的胱氨酸二硫鍵裂解，因此半胱氨酸雙加氧酶作為皮膚癬菌的另一致病因子成為一項(xiàng)研究熱點(diǎn)[12-13]。真菌頭癬致病的具體過程，其如何感染、生存，以及與宿主免疫、內(nèi)環(huán)境的關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。

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