胡建平，韓俊壘，湯兵祥

(河南省胸科醫(yī)院呼吸一病區(qū)，鄭州 450008)

支氣管哮喘是全球重點(diǎn)關(guān)注的異質(zhì)性疾病之一，嚴(yán)重危害公眾健康，主要表現(xiàn)為氣道慢性炎癥。哮喘發(fā)病機(jī)制及防治方法是目前臨床醫(yī)學(xué)急需解決的難題[1-2]。氣道重塑作為一種重要的哮喘性氣道改變，上皮肥厚及化生、肌層纖維細(xì)胞增殖，杯狀細(xì)胞增生，新生血管形成，基底膜下細(xì)胞外基質(zhì)沉積，氣道平滑肌的細(xì)胞增生等是其主要特點(diǎn)；若發(fā)生氣道重塑，可導(dǎo)致哮喘轉(zhuǎn)變?yōu)橄?慢阻肺重疊綜合征[3-4]。氣道上皮細(xì)胞在受到病原微生物、過(guò)敏原刺激后能分泌出多種細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子在哮喘免疫應(yīng)答、調(diào)控方面具有重要意義，其中白細(xì)胞介素(IL)-25是近年來(lái)醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)[5]。IL-25是IL-17細(xì)胞因子的家族成員之一，能啟動(dòng)、調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞，促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答[6]。研究顯示，哮喘患者、小鼠哮喘模型的血清及痰液、肺組織內(nèi)均存在高表達(dá)IL-25，基因過(guò)表達(dá)、外源性給予IL-25可導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性等類(lèi)似人類(lèi)哮喘樣改變[7]。平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是一種重要的平滑肌標(biāo)志物，膠原合成能力較強(qiáng)，具有一定收縮潛能，能對(duì)平滑肌收縮功能改變、數(shù)量進(jìn)行反映，能引起官腔收縮狹窄和哮喘發(fā)作，故α-SMA表達(dá)增加可能和哮喘氣道重塑、發(fā)作等具有密切關(guān)聯(lián)[8-9]。本研究為準(zhǔn)確識(shí)別哮喘內(nèi)表型差異，增強(qiáng)哮喘治療效果，對(duì)哮喘小鼠肺組織內(nèi)IL-25表達(dá)及IL-25對(duì)氣道重塑的影響進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 選取鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院飼養(yǎng)的90只雌性BALB/C小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，約8周齡，體質(zhì)量19～28 g。所有小鼠均飼養(yǎng)在具有空氣過(guò)濾的21～22 ℃恒溫房間，每間隔12 h實(shí)施1次光暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前小鼠自由飲水與攝食，鼠糧均接受輻照消毒，飲用水為高溫消毒的純凈水。本研究通過(guò)單位動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[201609-005]。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建小鼠哮喘模型 (1)90只小鼠分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組各45只，并隨機(jī)編號(hào)。(2)造模期間飲用水、鼠糧間隔2～3 d更換1次，鼠籠及墊料每周更換1次。(3)配制雞卵清蛋白(OVA)混懸液、霧化液：分別稱(chēng)取適量的OVA、氫氧化鋁，在0.25 mL無(wú)菌生理鹽水內(nèi)溶入OVA 100 mg，氫氧化鋁1 mg，制備為OVA混懸液，于60 min內(nèi)用完；再于1 mL生理鹽水內(nèi)溶入25 mg的OVA，攪拌均勻，配制成OVA(2.5%)生理鹽水溶液，霧化為氣溶膠后，可供小鼠吸入。(4)小鼠造模：①小鼠致敏，依據(jù)現(xiàn)配現(xiàn)用原則配制OVA混懸液，將100 mg的OVA、氫氧化鋁1 mg溶于0.25 mL無(wú)菌生理鹽水內(nèi)配制為致敏液體。②小鼠飼養(yǎng)第1天行致敏處理，將0.2 mL致敏溶液從腹腔注入小鼠體內(nèi)；對(duì)照組每只小鼠均經(jīng)腹腔注入生理鹽水0.2 mL。③飼養(yǎng)第8天再行致敏處理，將0.2 mL致敏溶液從腹腔注入小鼠體內(nèi)；對(duì)照組每只小鼠由腹腔注入生理鹽水0.2 mL。④飼養(yǎng)1～8 d，兩組小鼠均不接受任何處理，第8天致敏結(jié)束后至第15天期間不行任何處理，定期更換飲用水、鼠糧、墊糧及鼠籠。⑤飼養(yǎng)小鼠2周后，取出小鼠放進(jìn)霧化盒內(nèi)，實(shí)施小鼠霧化，每次抽取霧化液20 mL放進(jìn)霧化裝置內(nèi)，啟動(dòng)980超聲霧化器，實(shí)驗(yàn)組霧化吸入2.5%的OVA，30分鐘/次，持續(xù)霧化7 d；對(duì)照組霧化吸入0.9%生理鹽水，30分鐘/次，持續(xù)霧化7 d。⑥霧化完成后，于24 h內(nèi)處死小鼠。

1.2.2提取小鼠肺、支氣管組織 (1)根據(jù)每只小鼠體質(zhì)量給予注射水合氯醛麻醉，每10 g注射0.25 mL。(2)所有實(shí)驗(yàn)器材均經(jīng)高壓消毒無(wú)菌處理，取出小鼠1只眼睛，由內(nèi)眥靜脈取血，放入EP管(1.5 mL)內(nèi)，標(biāo)記編號(hào)；取完血后，用針頭將小鼠頭部、四肢固定，將細(xì)線套在小鼠牙齒上固定頭部。(3)后用鑷子、組織剪將小鼠頸部皮膚剪開(kāi)，將胸部、腹部皮膚剝離，使胸部、腹部組織與肌肉暴露；逐層剪開(kāi)頸部組織至頸部主支氣管、支氣管周?chē)钅そM織分離、暴露。用組織剪將小鼠胸骨、周?chē)M織去除，將小鼠胸腔剪開(kāi)，暴露肺臟。(4)由主支氣管進(jìn)留置針，經(jīng)留置針將0.9%生理鹽水注入小鼠肺組織內(nèi)至兩肺膨脹；靜置一段時(shí)間，回收肺內(nèi)液體，放進(jìn)EP管(1.5 mL)內(nèi)；取出肺泡灌洗液，將小鼠的肺組織與主支氣管分離并取出，用錫箔紙做好包裝。(5)小鼠腹腔用組織剪打開(kāi)并分離腹部臟器，鑷子取出脾臟，放進(jìn)甲醛冷凍管內(nèi)，標(biāo)記編號(hào)，放進(jìn)-80 ℃冰箱內(nèi)保存；解剖小鼠后對(duì)小鼠尸體進(jìn)行適當(dāng)處理。(6)小鼠血清、肺泡灌洗液放進(jìn)-80 ℃冰箱內(nèi)保存，肺氣管組織、脾臟組織放進(jìn)液氮罐內(nèi)保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)兩組小鼠血清、肺泡灌洗液內(nèi)IL-25、α-SMA，所有操作嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法 將制冰機(jī)開(kāi)啟，在10 mL離心管上分別標(biāo)記對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。由液氮罐內(nèi)取出兩組小鼠的肺臟組織并放進(jìn)冰塊內(nèi)，量取每只小鼠組織各200 g，分別置入10 mL的離心管內(nèi)，并將離心管置入冰塊內(nèi)，參照10∶1比例配制放射免疫沉淀法(RIPA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)組織裂解液。在每組EP管內(nèi)各加入組織裂解液100 mL，間斷振蕩。啟動(dòng)勻漿機(jī)，蒸餾水沖洗勻漿機(jī)勻漿頭、勻漿組織，每個(gè)樣品勻漿完均用蒸餾水沖洗勻漿頭，勻漿后放進(jìn)冰塊內(nèi)。在4 ℃離心機(jī)內(nèi)行12 000 r/min離心5 min。分別留取上清液放進(jìn)新EP管內(nèi)，放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存待用。用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測(cè)提取的肺臟蛋白質(zhì)濃度，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明執(zhí)行。配制5%脫脂奶，步驟為選取玻璃板，清洗、調(diào)整玻璃板，配膠，配制電泳液，加入提取蛋白質(zhì)、預(yù)染蛋白Marker，電泳，轉(zhuǎn)膜，洗膜，封閉，TBST清洗，加入IL-25抗體與內(nèi)參，TBST清洗，二抗孵育，顯影。

1.2.4免疫組織化學(xué)法 (1)制作切片：剪取肺組織塊約0.5 cm3，常規(guī)漂洗、固定、乙醇梯度洗脫，用二甲苯相關(guān)溶液浸洗肺及支氣管組織，包裝、切片、展片，充分展平后放在涂抹蛋白甘油的載玻片上，于38 ℃恒溫箱內(nèi)烘干，再染色。(2)免疫組織化學(xué)檢測(cè)：①將兩組小鼠肺組織放進(jìn)60 ℃恒溫箱內(nèi)烘烤，1 h后從烤箱內(nèi)取出載玻片于室溫下冷卻。②將肺組織切片放進(jìn)二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3內(nèi)各脫蠟10 min；取出載玻片依次放進(jìn)100%、95%、90%、80%、70%乙醇內(nèi)脫洗，各5 min，用蒸餾水漂洗5 min。③修復(fù)抗原：將組織切片放進(jìn)500 mL的0.01 mmol/L檸檬酸鹽溶液內(nèi)，微波高溫加熱至沸騰，12 min后停止加熱，自然冷卻至室溫；用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，5分鐘/次。在組織切片上各滴加1滴3%的H2O2后放進(jìn)濕盒內(nèi)浸泡10 min，將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶消除。取出載玻片，用PBS漂洗3次，3分鐘/次。④封閉：在組織切片上滴加非免疫性動(dòng)物血清50 mL，放進(jìn)濕盒內(nèi)封閉10 min，后取出載玻片用PBS緩沖液浸洗3次，3分鐘/次。⑤一抗孵育：根據(jù)1∶200比例將IL-25稀釋?zhuān)诮M織切片上滴加一抗，4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。⑥復(fù)溫：第2天從冰箱內(nèi)取出載玻片，自然復(fù)溫到室溫，用PBS浸洗3次，5分鐘/次。⑦二抗孵育：在各個(gè)組織切片上滴加1滴約50 mL二抗，放進(jìn)37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min，后放進(jìn)濕盒內(nèi)浸泡10 min；用PBS緩沖液浸洗3次，3分鐘/次。⑧顯色：在1 mL的DAB染色液底物緩沖液內(nèi)加入1滴DAB濃縮液進(jìn)行稀釋?zhuān)渲瞥蒁AB工作液，避光下使用；在組織切片上滴加50 mL稀釋后的DAB溶液，對(duì)染色時(shí)間進(jìn)行嚴(yán)格控制，后用自來(lái)水漂洗；DAB染色后的組織切片用蘇木精-伊紅(HE)染色1 min，染色后用自來(lái)水清洗1 min。⑨脫水：切片洗凈后實(shí)施乙醇梯度脫水及二甲苯脫水，具體操作說(shuō)明脫蠟步驟相反，脫水后蓋蓋玻片，對(duì)蓋玻片方向進(jìn)行校正，切片封好后放進(jìn)恒溫箱內(nèi)干燥。干燥后擦凈切片上殘余浮色，將標(biāo)簽貼在玻片左端，注明組織切片的名稱(chēng)、染色方法與日期、固定方法。于顯微鏡下對(duì)HE染色后的兩組小鼠組織切片進(jìn)行觀察。

1.2.5RT-PCR檢測(cè) 采用TaKaRa公司生產(chǎn)的Trizol試劑提取肺組織總RNA，定量后依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作制備cDNA。利用上海生物工程公司合成引物，采用SYBR Green法定量檢測(cè)IL-25 mRNA表達(dá)水平。其中，引物序列，上游5′-TGGACAGGACTTGAATCGG-3′，下游5′-CAGGAGTATGGCTTCCAGGGT-3′；GAPDH引物序列，上游5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′，下游5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGZTC-3′。將cDNA、引物和SYBR Green混合，分別在95 ℃、5 min，95℃、20 s，55 ℃、20 s，75 ℃、30 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。IL-25 mRNA表達(dá)水平采用相對(duì)定量法計(jì)算，用管家基因校正樣品初始量。

1.2.6觀察指標(biāo) 結(jié)果判定：細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，背景呈粉紅色，提示染色合格[10]。于400倍顯微鏡下觀察，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件對(duì)肺組織切片上α-SMA氣道平滑肌厚度進(jìn)行直接測(cè)量與分析，分析IL-25、α-SMA對(duì)氣道重塑的影響。

表1 兩組IL-25、IL-25 mRNA、α-SMA水平比較

2 結(jié) 果

2.1ELISA結(jié)果 對(duì)照組小鼠血清、肺泡灌洗液內(nèi)IL-25、α-SMA水平均低于實(shí)驗(yàn)組，肺組織內(nèi)IL-25 mRNA也低于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2小鼠哮喘模型鑒定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組小鼠在受到激發(fā)10 min后呼吸變快、加深，軀干、頭部、鼻子及面部皮膚均產(chǎn)生不同程度的瘙癢；早期發(fā)生躁動(dòng)癥狀，后期出現(xiàn)弓背、點(diǎn)頭呼吸、呼吸急促、口唇發(fā)紫、前肢縮抬及少動(dòng)等癥狀；嚴(yán)重小鼠發(fā)生大小便失禁、腹肌/肢體抽搐、呼吸減慢及反應(yīng)遲緩等情況；小鼠在受到多次連續(xù)激發(fā)后，進(jìn)食量縮減，體質(zhì)量相對(duì)減輕，提示成功制備哮喘模型。對(duì)照組小鼠未產(chǎn)生上述癥狀。

圖1 對(duì)照組肺組織IL-25表達(dá)(×200) 圖2 實(shí)驗(yàn)組肺組織IL-25表達(dá)(×200)

圖3 對(duì)照組α-SMA蛋白表達(dá)(×200) 圖4 實(shí)驗(yàn)組α-SMA蛋白表達(dá)(×200)

2.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組小鼠的肺組織病理切片表明小鼠具有完整的支氣管黏膜上皮與肌層，管腔規(guī)則，支氣管組織與結(jié)構(gòu)清晰、完整，組織周?chē)闯霈F(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏液分泌表現(xiàn)正常(圖1)；實(shí)驗(yàn)組小鼠支氣管的管壁增厚，黏膜上皮破損，管腔變狹窄，產(chǎn)生炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。α-SMA蛋白的陽(yáng)性表達(dá)主要在支氣管壁，支氣管壁上沉積棕褐色顆粒；實(shí)驗(yàn)組小鼠支氣管壁上的α-SMA蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，見(jiàn)圖3～4。

2.4蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠支氣管肺組織內(nèi)IL-25、α-SMA水平相對(duì)較高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

1：對(duì)照組，2～5：實(shí)驗(yàn)組

圖5兩組小鼠蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果

2.5相關(guān)性 實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織內(nèi)IL-25、α-SMA相關(guān)性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.751，P<0.05)。

3 討 論

相關(guān)研究指出支氣管哮喘的重要機(jī)制為T(mén)h1、Th2細(xì)胞比例失衡造成的免疫學(xué)改變，細(xì)胞因子分泌增多、Th2細(xì)胞數(shù)目增多、免疫反應(yīng)功能亢進(jìn)是其主要特點(diǎn)[11-13]。IL-25主要是由炎性細(xì)胞產(chǎn)生，是誘導(dǎo)支氣管哮喘氣道產(chǎn)生炎癥的重要中心介質(zhì)[14]。根據(jù)嗜酸性粒細(xì)胞引起的哮喘發(fā)現(xiàn)，嗜酸性粒細(xì)胞能誘導(dǎo)炎性細(xì)胞(肥大細(xì)胞)釋放組胺，釋放的組胺能導(dǎo)致支氣管平滑肌細(xì)胞肥大、支氣管基底膜的網(wǎng)狀組織增厚[15]。而Th2細(xì)胞在受到IL-25誘導(dǎo)后能釋放多種作用于不同細(xì)胞的趨化因子與細(xì)胞因子，并產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)，引發(fā)哮喘氣道炎癥，故預(yù)測(cè)IL-25在哮喘氣道重塑中可能發(fā)揮重要作用[16-17]。另有相關(guān)研究表明，α-SMA及膠原蛋白-1、E-鈣粘蛋白大量沉積在支氣管哮喘氣道黏膜下，與氣道重塑發(fā)生存在一定相關(guān)性；α-SMA表達(dá)增加使痙攣、狹窄加重，增加黏液分泌物，進(jìn)而引起抗透明質(zhì)等酸酶反應(yīng)，可能和哮喘癥狀發(fā)作、氣道重塑有關(guān)[17-19]。因此對(duì)哮喘患者肺組織內(nèi)IL-25、IL-25 mRNA、α-SMA表達(dá)進(jìn)行早期檢測(cè)，能為臨床防治哮喘提供新的參考依據(jù)。

李鴻佳等[20]研究發(fā)現(xiàn)，IL-25在哮喘患者氣道內(nèi)表達(dá)增加，能使上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞上相應(yīng)表達(dá)增加，提示IL-25與哮喘氣道重塑存在密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果說(shuō)明IL-25在哮喘小鼠肺組織內(nèi)表達(dá)水平較高，在哮喘病發(fā)過(guò)程中能經(jīng)一定相關(guān)機(jī)制引起氣道重塑，IL-25表達(dá)增加與哮喘氣道重塑存在一定相關(guān)性，故在哮喘氣道重塑發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中IL-25可能起到重要作用。本研究與李鴻佳等[20]研究結(jié)果相對(duì)一致。

綜上所述，哮喘小鼠肺組織、血清及肺泡灌洗液內(nèi)IL-25、α-SMA均呈相對(duì)高表達(dá)，根據(jù)IL-25、α-SMA正相關(guān)性，預(yù)測(cè)干預(yù)IL-25、下游因子表達(dá)，將相關(guān)通路、機(jī)制阻斷，能延緩或抑制氣道重塑，從而減輕哮喘臨床癥狀。

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